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第一部分放射线诱导鼻咽癌细胞上皮-间质转化的作用研究目的：检测放射线对鼻咽癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,探讨EMT在鼻咽癌获得性放疗抵抗中的作用。方法：X射线照射鼻咽癌细胞系HNE1、CNE2、CNE1、CNE1-LMP1;显微镜下观察记录细胞EMT形态学变化；Western blot技术检测EMT标记分子、基质金属蛋白酶2,9 (matrix metalloproteinase 2,9; MMP-2,9)蛋白水平变化；免疫荧光实验检测EMT标记分子的细胞定位与表达状况；划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力；Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力。结果：X射线照射后,鼻咽癌细胞HNE1、CNE2、CNE1、CNE1-LMP1发生典型EMT形态学改变；Western blot结果显示,照射后的鼻咽癌细胞以及放疗抵抗鼻咽癌细胞中E-cadherin表达减少,Vimentin、N-cadherin表达增多；免疫荧光实验显示：X射线照射后,鼻咽癌细胞间的E-cadherin表达量减少,而细胞浆内Vimentin表达量增多；划痕实验显示：照射后的鼻咽癌细胞迁移能力增强。而Transwell实验和Western blot结果显示：X射线照射后,鼻咽癌细胞的侵袭能力未发生明显变化；放疗组与未放疗组中鼻咽癌细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达水平无明显差异。结论：放射线可诱导鼻咽癌细胞出现典型EMT改变,而放疗抵抗鼻咽癌细胞具有间质细胞表型特征。研究结果提示,EMT参与鼻咽癌细胞的获得性放疗抵抗。第二部分放射线激活MET及其介导鼻咽癌上皮-间质转化与放疗抵抗的作用研究目的：检测放射线对原癌基因MET及下游信号分子的激活情况,探讨MET基因在放射线诱导鼻咽癌上皮-间质转化(EMT)以及鼻咽癌获得性放疗抵抗中的作用。方法：X射线照射鼻咽癌细胞系HNE1、CNE2、CNE1、CNE1-LMP1; ELISA实验检测鼻咽癌细胞中HGF自分泌水平；Real-time PCR (RT-PCR)实验检测鼻咽癌细胞中MET mRNA表达水平;Western blot技术检测鼻咽癌细胞中c-Met及下游信号分子的活化情况；慢病毒转染RNA干扰技术沉默MET基因表达,RT-PCR、Western blot技术检测MET基因沉默效应；克隆形成实验用于检测X射线照射后的细胞克隆形成率,并绘制细胞生存曲线以比较细胞增殖能力。结果：X射线照射后,鼻咽癌细胞自分泌HGF水平轻度升高,而MET mRNA及c-Met蛋白表达水平明显升高；X射线可激活c-Met及其下游信号分子,照射后的鼻咽癌细胞中p-c-Met、p-Stat3、p-Akt、p-erk1,2蛋白量表达增多；MET基因沉默鼻咽癌细胞组中,放射线诱导的EMT改变受到抑制、c-Met下游信号分子活化减弱、鼻咽癌细胞增殖能力降低。结论：放射线可激活c-Met及其下游信号分子；而沉默MET基因可阻断放射线诱导的EMT改变以及c-Met信号活化,并增加鼻咽癌细胞的放疗敏感性。研究结果提示,MET基因在放射线诱导EMT以及鼻咽癌放疗抵抗中发挥重要作用。第三部分MET介导上皮-间质转化调控鼻咽癌放疗抵抗的分子机制探讨目的：探讨MET基因介导上皮-间质转化调控鼻咽癌放疗抵抗的可能分子机制。方法：Western blot技术检测照射后鼻咽癌细胞中E-cadherin、β-catenin、c-Myc、CyclinD1分子表达情况。免疫荧光实验检测放疗前后E-cadherin、β-catenin的细胞定位以及表达情况。流式细胞术检测X射线照射后鼻咽癌细胞的细胞周期分布、细胞凋亡情况。结果：Western blot结果显示,鼻咽癌细胞照射后出现E-cadherin表达减少,p-catenin入核增多；而沉默MET基因后,核内P-catenin表达量降低,同时下游靶基因c-Myc、Cyclin D1表达减少。免疫荧光实验显示：X射线照射后,鼻咽癌细胞之间的E-cadherin蛋白表达减少,P-catenin入核增多,而沉默MET基因后,P-catenin入核减少。流式细胞术结果表明：MET基因沉默组与随机序列对照组相比,X射线照射引起的G2/M期细胞比例显著增加、细胞凋亡率升高。结论：沉默MET基因可引起鼻咽癌细胞P-catenin入核减少、P-catenin下游靶分子c-Myc-Cyclin D1表达量降低,而且可以导致鼻咽癌细胞发生G2/M期阻滞、细胞凋亡率增加。研究结果提示,MET基因介导的EMT可能是通过下调E-cadherin表达,促进β-catenin入核,进而激活下游与细胞周期与细胞凋亡相关的靶基因c-Myc、CyclinD1,最终引起鼻咽癌细胞发生获得性放疗抵抗。