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研究目的：目前对缺血再灌注损伤的机制尚不完全清楚。本体水平下,心肌细胞在遭受缺氧复氧损伤后,细胞活性如何,以及内源性HO-1的表达随缺氧复氧时间变化又会有怎样的变化,将是这一部分实验所要探讨的主题。研究方法：H9c2细胞系,更换成DMEM无血清培养液,37℃、2.5%O2、5%CO2、92.5%N2三气培养箱中培养24h;更换为细胞更换成DMEM无血清培养液,37℃、5%CO2常氧培养箱中培养2h,6h、12h、18h和24h。采用CCK8试剂盒孵育后在450mM 波长处测定OD值,以此间接反映活细胞数量。采用RT-PCR法检测在缺氧复氧损伤中HO-1 mRNA变化水平,采用RT-PCR和Western blot法H/R过程中HO1,p62和LC3Ⅱ蛋白表达水平。研究结果：缺氧复氧2h后细胞活性最低,细胞的毒性损伤最严重,而缺氧复氧18h后细胞活性逐渐趋于稳定,复氧12h、18h、24h组与复氧2h组相比,***p<0.001,具有统计学差异。复氧2h时,HO-1的表达最高,复氧12h、18h和24h后,HO-1的表达水平明显降低,p<0.01,具有统计学差异。HO-1的蛋白表达水平,随着复氧时间的延长,逐渐降低,在复灌12h之后,稳定处于较低水平。结论：缺氧复氧会导致H9c2发生细胞损伤。为实验目的,本实验选择损伤程度约40%的时间点,即缺氧复氧6h用于后续实验模型。研究目的：线粒体是真核细胞内能量转换的重要细胞器,在低氧环境中,线粒体是最为敏感的细胞器,它会对自身的功能进行重大调整以此来尽可能的适应低氧环境。细胞自噬是另一种缺氧复氧导致的细胞损伤下的保护机制。缺氧复氧时,心肌细胞线粒体功能和细胞自噬水平如何,将是这一部分实验所要探讨的主题。研究方法：H9c2细胞系,更换成DMEM无血清培养液,37℃、2.5%02、5%C02、92.5%N2三气培养箱中培养24h;更换为细胞更换成DMEM无血清培养液,37℃、5%CO2常氧培养箱中培养2h、6h、12h、18h和24h。采用CCK8试剂盒孵育后在450mM波长处测定OD值,以此间接反映活细胞数量。采用RT-PCR法检测在缺氧复氧损伤中HO-1 mRNA变化水平,采用RT-PCR和Western blot法H/R过程中HO1,p62和LC3Ⅱ蛋白表达水平。JC-1法(线粒体膜电位)和Mito-Sox法(ROS)检测H9C2缺氧复氧损伤中线粒体功能的影响。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。激光共聚焦拍摄自噬小体和自噬溶酶体数量。研究结果：复氧6h后,Rapamycin和TSA作为自噬诱导剂预处理后,可以抑制H/R诱导的损伤。常氧组,HO-1表达增高,而p62和LC3-Ⅱ表达较低,但是在H/R组,HO-1的表达明显降低(*p<0.05),p62水平明显增加(*p<0.05),LC3-Ⅱ表达水平也有升高(*p<0.05)。在经过Rapamycin和TSA的诱导后,LC3Ⅱ明显升高(#p<0.05),p62明显降低(#p<0.05),细胞自噬流比较通畅。同时可见,Rapamycin和TSA可以促进HO-1的的蛋白水平升高(#p<0.05),在H/R组,黄色荧光明显增加(**p<0.01),自噬下游受阻。在Rapamycin和TSA组,红色荧光明显增加(##p<0.01),自噬下游通畅。缺氧复氧时,细胞发生了自噬,p62水平和LC3-Ⅱ表达水平均有明显升高,而且自噬下游受阻。心肌细胞缺氧复氧后,线粒体膜电位明显下降(**p<0.01),线粒体活性氧含量明显降低(***p<0.001),当用自噬Marker后,在Rapamycin和TSA组,自噬水平增加同时,线粒体膜电位也明显升高(##p<0.01),线粒体活性氧含量明显明显下降(**p<0.01,##p<0.01)。说明自噬发生时,有助于线粒体膜的稳定性和线粒体活性氧物质的产生。结论：缺氧复氧时,细胞发生了自噬,p62水平和LC3-Ⅱ表达水平均有明显升高。Rapamycin和TSA作为自噬诱导剂预处理后,可以抑制H/R诱导的损伤,并促进HO-1的的蛋白水平升高。自噬水平增加同时,线粒体膜电位也明显升高,线粒体活性氧含量明显明显下降。研究目的：线粒体被认为在心肌缺血再灌注损伤(I/R)过程中起重要作用。细胞自噬,是一个分解代谢过程,通过保护细胞溶酶体依赖机制降解受损的胞质蛋白和细胞器。HO-1是心肌细胞发生缺氧复氧损伤时的重要保护机制。但是HO-1蛋白对细胞缺氧复氧损伤后自噬水平和线粒体功能障碍的调控机制研究目前还不清楚。研究方法：H9c2细胞系,更换成DMEM无血清培养液,37℃、2.5%O2、5%CO2、92.5%N2三气培养箱中培养24h；更换为细胞更换成DMEM无血清培养液,37℃、5%CO2常氧培养箱中培养2h、6h、12h、18h和24h。采用CCK8试剂盒孵育后在450mM波长处测定OD值,以此间接反映活细胞数量。采用RT-PCR法检测在缺氧复氧损伤中HO-1 mRNA变化水平,采用RT-PCR和Western blot法H/R过程中HO1,p62和LC3Ⅱ蛋白表达水平。JC-1法(线粒体膜电位)和Mito-Sox法(ROS)检测H9C2缺氧复氧损伤中线粒体功能的影响。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。激光共聚焦拍摄自噬小体和自噬溶酶体数量。研究结果：HO-1基因在H9C2细胞中过表达之后,可以明显抑制H/R诱导的细胞损伤。Lv-HO1-H9c2细胞系,在常氧组可见具有明显的过表达作用(5 fold) (**p<0.01), Lv-HO1-Normoxia组与Lv-scramble-Normoxia组相比,具有统计学差异(**p<0.01)；复氧之后,Lv-HO 1-H/R组与Lv-scramble-H/R组HO-1的mRNA的表达水平虽然具有非常明显的降低,但是Lv-HO 1组仍然明显高于Lv-scramble组,由此可见,细胞缺氧复氧会明显降低HO-1mRNA的稳定性,即使在HO-1过表达的情况下。比较各组细胞HO-1、p62、LC3-Ⅱ的表达水平比较。由实验结果可知,常氧状态下,Lv-HO 1-Normoxia组与Lv-scramble-Normoxia组相比(***p<0.001),具有统计学差异。说明HO-1过表达细胞系构建成功。在H/R下,Lv-HO 1-H/R组与Lv-scramble-H/R组相比(##p<0.01),具有统计学差异。HO-1过表达后,H/R下,LC-3表达升高,而p62表达降低,Lv-HO1-H/R组与Lv-scramble-H/R组相比(##p<0.01),具有统计学差异。进一步验证各组别细胞自噬体和自噬流的变化,在Lv-scramble细胞系中,H/R组与常氧组比较,黄色荧光明显增加,自噬体数量增加(*p<0.05),而在H/R后,Lv-HO-1-H/R组与与Lv-scramble-H/R组比较,红色荧光明显增加,自噬溶酶体数量增加(##p<0.01),说明自噬流下游通畅。构建Lv-HO1-H9c2细胞系后,外源性HO-1表达水平升高,在H/R处理后,线粒体膜电位也明显升高(#p<0.05),线粒体内活性氧含量也明显下降(**p<0.01,#p<0.05)。Lv-scramble-H/R组与Lv-scramble-Normoxia组比较,细胞凋亡率明显增加(**p<0.01), Lv-HO1-H/R组和Lv-scramble-H/R组比较,细胞凋亡率却有明显减少(##p<0.01),说明HO-1过表达后可以降低细胞的凋亡率,保护细胞。采用ZnPP抑制HO-1的活性,HO-1表达降低(*p<0.05),LC-3表达降低(#p<0.05),p62表达升高(#p<0.05),自噬流受阻,同时线粒体膜电位明显下降(**p<0.01),线粒体活性氧含量明显增加(**p<0.01)。结论：HO-1可以通过促使自噬途径保护细胞缺氧复氧损伤导致的线粒体功能障碍。HO-1过表达后,可通过促使细胞自噬流的发生,以及对线粒体膜的稳定性和降低氧化产物的保护作用来防止心肌细胞缺氧复氧损伤。