目的：胆囊胆固醇结石的形成机制一直是国内外胆道疾病领域的研究热点,已有的研究表明胆囊动力障碍在胆囊胆固醇结石的形成中发挥了重要作用。以往的研究多集中于观察成石过程中胆囊动力发生变化的现象,而对其发生机制的探讨不足。有研究认为,高胆固醇诱发动物成石过程中胆囊动力的下降可能是胆固醇通过调节离子通道活性或是通过改变细胞膜上的受体-配体结合或是通过改变收缩蛋白活性实现的。随着Cajal间质细胞在胃肠动力中的调节作用被肯定,其在胆囊动力调控中的作用以及与胆系疾病发生的关系成为人们关注的热点。本课题以在豚鼠和人体胆囊中发现Cajal样间质细胞的形态学证据为基础,以高胆固醇诱发动物成石过程中胆囊动力下降的现象为线索,探讨Cajal样间质细胞在豚鼠胆囊胆固醇结石形成中的作用。我们通过建立豚鼠胆囊胆固醇结石模型,观察豚鼠胆囊中Cajial样间质细胞的形态学和超微结构特征,同时观察胆固醇结石形成过程中Cajal样间质细胞的变化及胆囊对外源性胆囊收缩素CCK收缩反应的变化,初步探讨胆囊胆固醇结石形成过程中胆囊动力下降的机制。并进一步比较正常离体胆囊肌条及去除Cajal样间质细胞的胆囊肌条慢波和张力的变化,探讨Cajal样间质细胞与CCK的作用关系,分析CCK发挥促胆囊收缩的可能机制。另外采用逆转录聚合酶链反应及蛋白印记方法比较对照组与成石组豚鼠胆囊c-kit及scf mRNA和蛋白表达的变化情况,从分子生物学角度分析Cajal样间质细胞发生变化的可能信号途径。为临床治疗和预防胆囊胆固醇结石提供新的理论依据。　　 方法：　　 一、实验对象　　 健康雄性豚鼠100只,体重120～150g,随机分为2组:(对照组/CON组50只,致石组/CG组50只),适应性饲养一周后,分别给予普通饲料及致石饲料。致石周期为6周,饲养期结束后观察各指标。　　 二、标本采集　　 10％水合氯醛腹腔注射麻醉后采集豚鼠胆囊标本、胆囊胆汁标本、胆石标本。　　 三、实验方法和检测指标　　 1、致石率评定及红外光谱结石定性:解剖显露豚鼠胆囊,肉眼即可清晰辨别胆囊结石形成情况,采用红外光谱溴化钾压片法,对结石成分进行定性,统计结石形成率。　　 2、胆囊胆汁涂片后于偏振光显微镜下观察。　　 3、制各豚鼠胆囊丙酮灌注标本及胆囊全层铺片标本。　　 4、免疫组织荧光化学染色方法研究豚鼠胆囊组织中Cajal样间质细胞的形态学和分布特征。并比较对照组与致石组Cajal样间质细胞数量和形态的变化。　　 5、透射电镜下观察豚鼠胆囊Cajal样间质细胞的超微结构特征。　　 6、颈静脉置管后以17nmol/kg的剂量给予外源性CCK-8,收集每10min肝胆汁计量统计。　　 7、制备离体豚鼠胆囊肌条,RM6240HJ型多道生理信号采集处理系统记录胆囊肌条慢波情况,比较正常组与去除Cajal样间质细胞组胆囊肌条慢波频率和振幅的变化。　　 8、RM6240HJ型多道生理信号采集处理系统记录胆囊肌条张力情况,比较正常组与去除Cajal样间质细胞组胆囊肌条对不同浓度CCK-8的收缩反应变化。　　 9、Western Blot法研究对照组与致石组胆囊组织中c-kit蛋白的变化情况。取胆囊组织标本,提取蛋白,SDS凝胶电泳,ECL化学发光法检测c-kit蛋白在转录后水平的变化情况。　　 10、Western Blot法研究对照组与致石组scf蛋白的变化情况,方法同上。　　 11、RT-PCR法研究对照组与致石组胆囊组织中c-kit蛋白在mRNA水平上的改变:取胆囊组织标本,提取总RNA,扩增目的基因,观察c-kit蛋白在mRNA水平的变化情况。　　 12、RT-PCR法研究对照组与致石组胆囊组织中scf蛋白在mRNA水平上的变化情况,方法同上。　　 结果：　　 一、豚鼠胆囊胆固醇结石模型构建情况对照组豚鼠成石率为0％(0/43),致石组豚鼠成石率为100％(35/35),明显高于对照组。结石经溴化钾压片法红外光谱检测证实为胆固醇结石。　　 偏振光显微镜下对照组胆囊胆汁内未见胆固醇结晶,致石组胆囊胆汁可见典型胆固醇结晶。　　 二、豚鼠胆囊Cajal样间质细胞免疫荧光化学染色结果豚鼠胆囊肌层中存在c-kit阳性的ICLCs,细胞呈梭形或卫星形,胞核巨大,为卵圆形,核周胞浆少,有2～5个长分支细胞突起。可以观察到ICLCs之间紧密相连。致石组ICLCs平均阳性面积较对照组明显减少(18.37±0.64％ vs2.47±0.28％,t=21.122,P＜0.01)。　　 三、豚鼠胆囊CajaIl间质细胞超微结构观察ICLCs呈长的,电子密度高的,肌样的细胞。染色质分散,胞质少。胞内有液泡,基底膜不完整。这些细胞直接与GBSM细胞接触,还发现ICLCs被无髓神经纤维包绕。　　 四、豚鼠胆囊收缩功能实验(CCK-8干预实验)外源性CCK-8干预实验显示致石组胆囊胆汁时间流量曲线下面积较对照组明显减少,胆囊对CCK-8反应性下降。　　 五、豚鼠离体胆囊肌条慢波和张力的测定结果正常组胆囊肌条慢波频率为27.9±1.91次/min,变异系数为6.85％,慢波振幅为0.63±0.07mV,变异系数为10.97％。亚甲蓝染色组胆囊肌条慢波频率为26.81±1.87次/min,变异系数为6.99％,慢波振幅为0.61±0.06mV,变异系数为9.48％;ICLCs破坏组胆囊肌条慢波频率为9.92±1.52次/min,变异系数为15.4％,慢波振幅为0.16±0.03mV,变异系数为20.37％,与正常组及单纯亚甲蓝染色组相比频率减低,振幅减小,差异有统计学意义(P＜0.01)。　　 正常组胆囊肌条对10-5mol/L、10-6mol/L、10-17mol/L及10-8mol/L的CCK-8反应的张力效应值分别为2.82±0.36g、1.42±0.25g、1.11±0.15g和0.64±0.08g;单纯亚甲蓝染色组胆囊肌条的相应效应值分别为2.77±0.35g、1.37±0.27g、1.11±0.16g和0.58±0.1g;ICLCs破坏组胆囊肌条的相应效应值分别为0.53±0.11g、0.34±0.03g、0.16±0.05g和0.06±0.02g,与正常组及单纯亚甲蓝染色组相比张力效应值明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01)。　　 破坏ICLCs组,细胞明显肿胀,线粒体肿胀,细胞质膜内多发空泡变性伴破裂,而平滑肌细胞未受影响。　　 六、豚鼠胆囊c-kit及scf蛋白改变情况Western Blot结果显示,与对照组相比,致石组豚鼠胆囊c-kit(t=10.256,P＜0.01)及scf蛋白(t=9.586,P＜0.01)表达量下降。　　 RT-PCR结果显示,与对照组相比,致石组豚鼠胆囊c-kit(1=6.985,P＜0.01)和scf(t=6.028,P＜0.01)的tuRNA水平的表达量下降。　　 结论：　　 1、饮食诱导的豚鼠胆囊胆固醇结石形成过程中,胆囊Cajal样间质细胞明显减少,胆囊动力受损,对外源性CCK反应下降。　　 2、胆囊ICLCs不仅仅产生慢波电位,也调节着CCK对平滑肌的活性。　　 3、c-kit/scf通路抑制可能与成石过程中ICLCs数量减少有关。