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Mex3A和Mex3B是Mex3家族的两个重要成员,早期的研究表明它们在细胞极化、不对称分裂与凋亡等重要生命活动中发挥作用。前期,我们发现鱼类Mex3A、Mex3B可能参加先天免疫反应,然而,其功能和相关的机制却未见报道。鱼类为低等脊椎动物,主要依靠先天免疫来抵抗各种病原微生物的入侵。因此,为深入研究鱼类Mex3A与Mex3B的功能,我们利用同源克隆的方法在草鱼中克隆和鉴定了Mex3A和Mex3B,并将其分别命名为CiMex3A和CiMex3B。CiMex3A（序列号:MW368974）最大开放阅读框长度为1521bp,编码506个氨基酸。为研究CiMex3A能否在先天免疫中发挥功能,我们首先采用LPS、ZDNA、poly（I:C）刺激细胞,并分析CiMex3A在不同刺激下的表达情况。研究表明,在LPS,Z-DNA以及胞外poly（I:C）刺激条件下,CiMex3A的表达量可见明显上调,相比于其他刺激源而言,胞内poly（I:C）刺激CiMex3A的上调相则更加明显。因此,CiMex3A可能参与了先天免疫应答。过表达CiMex3A,发现IFN1、ISG15以及炎症因子IL6、TNFα的表达有明显的下调;同时,在poly（I:C）刺激条件下,CiMex3A也能够降低IRF3的磷酸化水平。为探讨CiMex3A负调节先天免疫机制,我们通过免疫共沉淀技术,成功筛选到了CiMex3A的作用底物Ci RIGI。共定位实验证实,经poly（I:C）刺激后,CiMex3A和Ci RIG-I都可定位于内质网,但都不定位于溶酶体。此外,CiMex3A也几乎不定位于线粒体或内体。然而,Ci RIG-I的定位与CiMex3A稍有不同,研究结果显示,它不仅可以定位于早期内体,并且在poly（I:C）刺激条件下还能够向晚期内体转移。此外,Ci RIG-I还能定位于线粒体。泛素化是RIG-I活化的一种重要形式,为探究E3泛素连接酶CiMex3A是否也能够泛素化Ci RIG-I,我们开展了Ci RIG-I的泛素化实验,结果表明,在poly（I:C）刺激下,CiMex3A能够明显促进Ci RIG-I泛素化,并能够引起Ci RIG-I的降解。进一步分析CiMex3A的结构,我们发现,CiMex3A主要包含KH结构域和RING结构域,为分析这两个结构域对Ci RIG-I的活性影响,我们开展了突变体实验。结果证实,缺失RING结构域后,CiMex3A依然能够和Ci RIG-I相互结合,但它们泛素化和降解Ci RIG-I的的能力明显受到抑制。这就说明RING结构域对CiMex3A功能发挥非常重要。综上,在poly（I:C）刺激条件下,CiMex3A在先天免疫中起负调节因子的作用,该作用的实现源于CiMex3A对Ci RIG-I的泛素化修饰,并由此导致Ci RIGI的降解。CiMex3A的一个旁系同源基因——CiMex3B（序列号:MT276802.1）,它最大开放阅读框长度为1578 bp,编码525个氨基酸。与CiMex3A类似,CiMex3B同为Mex3家族成员,为探究其是否也能够在先天免疫方面发挥作用,在CIK细胞中我们开展了CiMex3B的过表达实验。研究发现,在poly（I:C）刺激条件下CiMex3B能够上调IFN1、ISG15、MX2和炎症相关因子IL6、IL8以及TNFα的表达。因此,CiMex3B作为一个正调控因子参与到先天免疫过程中。我们通过对CiMex3B的底物进行筛选发现,Ci TLR3和Ci TRIF是CiMex3B的两个重要靶标。前期哺乳类的众多研究揭示出TLR3可以在内体上发挥重要功能。而我们感兴趣地是CiMex3B和Ci TLR3在poly（I:C）刺激下的定位情况。通过共定位分析实验我们发现,CiMex3B与Ci TLR3都可以定位于晚期内体、线粒体和内质网,而基本不定位于溶酶体。这就表明了CiMex3B与Ci TLR3在细胞内的亚定位并非固定不变,它们在细胞内的分布可能会随着功能的改变而发生变化。上述研究证实了CiMex3B是作为一个正调控因子而发挥功能。随后,我们共转CiMex3B和Ci TLR3后发现,IRF3的磷酸化水平以及IFN1的表达水平明显比单转染CiMex3B或Ci TLR3效果更加显著。因此,CiMex3B与Ci TLR3是通过协同作用来正调控先天免疫应答。考虑到TLR3的活性形式,以及CiMex3B拥有同CiMex3A高度同源的结构域,我们探究了CiMex3B对Ci TLR3的泛素化影响。研究表明,CiMex3B促进Ci TLR3发生K63泛素链连接的泛素化。进一步研究还发现,CiMex3B（1-220）突变体和野生型CiMex3B定位相同,而突变体CiMex3B（221-525）在细胞的定位却发生了改变,即由在细胞质分布变为核质均有分布。意外地是,CiMex3B（221-525）突变体虽可以与Ci TLR3结合却丧失了促进Ci TLR3发生K63泛素链连接的泛素化的能力。因此,CiMex3B是通过促进Ci TLR3发生K63泛素链连接的泛素化而正调控先天免疫应答。既然CiMex3A和CiMex3B都能够参与先天免疫,而两者之间的联系值得进一步分析。我们研究发现,CiMex3A和CiMex3B都与斑马鱼在亲缘关系上比较接近。此外,通过蛋白序列比对分析,我们发现,CiMex3A和CiMex3B具有高度同源的KH结构域和RING结构域。共定位分析显示出了CiMex3A和CiMex3B能够发生共定位。同时,GCRV刺激条件下,CiMex3A和CiMex3B也能够明显地上调。因此,CiMex3A和CiMex3B不仅能够参与先天免疫应答,并且在结构以及定位模式上也十分类似。意外地是,它们却参与了不同的信号通路,CiMex3A通过促进Ci RIG-I的泛素化和降解在先天免疫通路中起到负调控的作用;CiMex3B则能够促进Ci TLR3发生K63泛素链连接的泛素化正调控先天免疫应答。然而,CiMex3A和CiMex3B在其中的功能分化及其生物学意义有待今后进一步分析。