研究背景及目的肝癌(liver cancer)是常见恶性肿瘤之一,主要分布在亚洲太平洋沿岸及非洲的东南部地区。据世界卫生组织2005年全球肿瘤统计分析表明,目前每年新患肝癌人数为62.6万,死亡59.8万人,我国肝癌占全世界40%-55%,诊治形势十分严峻。近年来,随着对肝癌早期诊断和治疗手段的进步,使肝癌患者的5年生存率有所提高。尽管关于肝癌的治疗研究取得了较大进展,新技术和新方法也层出不穷,但对肝癌仍缺乏有效的治疗手段,治疗肝癌的研究工作仍十分紧迫。近年来人们开始研究通过抑制肝肿瘤血管的生成,来达到抑制肿瘤的目的。发现肿瘤的生长和转移与新生血管生成有着密切联系。肿瘤细胞通过新生血管获取营养和氧气,也通过新生血管向身体的远处部位转移。如果能切断供应肿瘤生长的血管,理论上能够饿死肿瘤细胞,并且阻止肿瘤的转移。目前已发现能促进血管生成的因子主要有：血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、血管生成素(angiogenin)、表皮生长因子(EGF)等；而与之作用相反的抑制血管生成的因子主要包括：血管抑素(vascular inhibition)、内皮抑素(Endostatin)、凝血酶敏感蛋白21(thrombospondin21)、血小板因子24(platelet factor24)等。在正常情况下,新生血管生成主要在组织再生、女性黄体生成期及孕期发生。内皮抑素作为抑制肿瘤血管生长因子之一,最初是从鼠成血管细胞瘤株培养液中分离提纯得到的一种20kD的内源性糖蛋白,能特异性地作用于新生血管内皮细胞生长的一种抑制因子,通过对其N端18个氨基酸序列测定,发现该因子是胶原ⅩⅧ因子羧基末端水解片段,在小鼠中对肿瘤诱导的血管生成几乎具有完全的抑制作用,能直接抑制内皮细胞的增殖、转移并诱导其凋亡而发挥其抗血管生成的作用,显示出很强的抗肿瘤活性。近年来对内皮抑素直接抑制某些肿瘤细胞生长和侵袭转移的研究也有了初步的报道。美国Entremed公司曾经采用酵母作为表达体系来生产内皮抑素,1999年2002年先后对内皮抑素进行了Ⅰ期及Ⅱ期的临床实验研究,但由于内皮抑素体外的不稳定性和生产成本高等原因,使其停滞于Ⅱ期临床试验。我国江苏先声药业采用大肠杆菌基因工程作为蛋白表达体系生产出来一种新型的内皮抑素,其稳定性,生物活性、产品纯度有了较大的改善,并且其半衰期延长、生产成本降低并缩短了生产周期。在多项动物实验中均显示出其能有效的抑制内皮细胞的增殖、血管生成及肿瘤生长的作用。内皮抑素具有以下优点：药物较易接近内皮细胞；少量的内皮细胞的损伤就可以使大量肿瘤细胞死亡,治疗肿瘤具有广谱性；内皮抑素药物具有低毒性,副反应较小；内皮细胞基因稳定,不容易突变,耐药性比较低；抗新生血管生成治疗可以增强肿瘤细胞对放、化疗的敏感性。研究表明,单独应用抗血管治疗肿瘤作用有限。近年来,联合抗血管治疗已经受到人们的广泛关注,内皮抑素联合化疗治疗乳腺癌、肺癌等肿瘤模型已取得了较好的效果。在国内,临床上已用于联合长春瑞滨和顺铂方案治疗初治或复治的Ⅲ/Ⅳ期非小细胞肺癌(NSCLC)等,并取得了较好的疗效,但对肝癌治疗基础研究尚不是很完善,尚需进一步研究。肝脏肿瘤血管具有丰富,扭曲的特点,在对血管丰富的肝癌实体瘤的治疗方面,内皮抑素可能起到积极的作用。内皮抑素静脉用于抗肿瘤血管生成治疗要反复输入高浓度药物,在临床应用上受到一定的限制。若能改变内皮抑素给药途径,如瘤体内给药,提高肿瘤组织中的药物浓度,可能会提高内皮抑素的治疗疗效。因此,本课题采用建立昆明小鼠皮下肝癌移植肿瘤模型的方法,在联合阿霉素化疗的基础上,从抗血管生成和杀伤肿瘤细胞两方面对肝癌的治疗进行研究,观察其对昆明小鼠肝移植瘤的抑制和杀伤作用,探讨内皮抑素治疗肝癌的价值。并进一步观察在联合化疗药基础上,内皮抑素瘤内给药及静脉给药的抑瘤效果及对小鼠生存期的影响,为内皮抑素治疗肝癌研究提供理论依据。方法第一部分将H22鼠源性肝癌细胞接种到40只18～22g昆明种小鼠的背部皮下,待接种肿瘤直径约1cm左右时,将40只昆明小鼠随机分成4组：(1)对照组：隔日尾静脉注射生理盐水0.1 ml+腹腔注射生理盐水0.1 ml；(2)联合用药组：隔日尾静脉推注内皮抑素10 mg/kg 0.1 ml+腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1ml；(3)内皮抑素组：隔日尾静脉推注内皮抑素10mg/kg 0.1 ml+腹腔注射生理盐水0.1 ml；(4)阿霉素组：隔日腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1 ml+尾静脉注射生理盐水0.1 ml；共给药14 d。每组取5只昆明小鼠,每3天测量皮下肿瘤直径,绘制肿瘤生长曲线,比较各组的抑瘤率,检测血浆VEGF浓度、肿瘤组织微血管密度(MVD),每组剩余5只小鼠正常饲养观察其中位生存期。第二部分将鼠源性H22肝癌细胞接种到40只昆明种小鼠的背部皮下,肿瘤直径约1cm时按体重将40只小鼠随机分成4组：(1)对照组：隔日瘤内注射生理盐水0.1 ml+腹腔注射生理盐水0.1 ml；(2)内皮抑素瘤内组：隔日瘤内注射内皮抑素10mg/kg 0.1 ml+腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1 ml;(3)内皮抑素静脉组：隔日尾静脉推注内皮抑素10 mg/kg 0.1 ml+腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1ml；(4)阿霉素组：隔日尾静脉推注生理盐水0.1 ml+腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1ml。每3天测量皮下肿瘤直径,绘制肿瘤生长曲线,比较各组的抑瘤率,第15天每组处死5只小鼠,检测血浆VEGF含量、肿瘤组织MVD,观察每组剩余5只小鼠的中位生存期。结果第一部分治疗结束后,联合用药组小鼠肿瘤体积显著小于其它各组,有统计学差异(P<0.05),血浆VEGF水平及瘤组织中MVD表达较其他各组显著减低,有统计学差异(P<0.05),且生存时间较其他各组显著延长,有统计学差异(P<0.05)；但内皮抑素组血浆VEGF水平与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。第二部分内皮抑素瘤内组小鼠肿瘤体积大小、血浆VEGF水平及肿瘤组织MVD均小于其他3组,有显著性差异(P<0.05),内皮抑素瘤内组及内皮抑素静脉组小鼠生存期均较阿霉素组、对照组延长,组间有显著性差异(P<0.05),但内皮抑素瘤内组及内皮抑素静脉组二者之间生存期无显著性差异(P>0.05)。结论1、内皮抑素联合阿霉素抑制小鼠肝肿瘤作用优于内皮抑素单药治疗或阿霉素单药治疗,二者具有协同效应；联合治疗组能显著延长荷瘤小鼠中位生存期。2、在联合阿霉素的基础上,瘤内局部应用内皮抑素较静脉全身应用内皮抑素对昆明小鼠肝癌移植瘤具有更明显的抑制和杀伤作用,近期疗效显著,但前者对荷瘤小鼠生存期的延长较后者无区别。