肉毒毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）是已知对人类毒性最强的物质,其最经典的血清型分类为A-G型,可引起人和动物发生以肌肉松弛性麻痹为主要症状的肉毒中毒。食源性肉毒中毒、婴儿肉毒中毒和创伤性肉毒中毒是其最常见的中毒形式,国内外肉毒中毒事件时常发生。由于肉毒毒素毒性极强,缺乏准确可靠的临床实验室检测方法以及治疗不及时而导致的中毒死亡事件屡次发生。近年来,随着肉毒毒素在医疗美容领域的广泛使用,因注射非正规渠道来源的肉毒美容产品或是不当的使用方式而导致的肉毒中毒亦呈明显上升趋势,对于公众健康安全造成的威胁不容忽视。此外,肉毒毒素易于制造、散播和滥用,被列为最具威胁的六种生物战剂之一,与肉毒有关的军事及生物恐怖袭击事件会造成国际社会的极大恐慌。因此,建立对其快速准确的血清型区分及活性测定方法,具有极其重要的医学与军事意义。目前,已发展多种肉毒毒素的检测方法,其中以小鼠生物试验法、免疫学检测法以及PCR法应用较为广泛。然而,上述检测方法具有一定的局限性,例如无法同时区分血清型与测定毒素活性、复杂基质样品检测易出现假阳性、方法灵敏度较低等。近年来,基于质谱的检测方法已成为新的发展趋势,但目前基于LC-MS/MS（MRM）检测的方法仍然较为匮乏,且方法缺乏在临床样本中的应用与验证,难以为临床诊治提供科学可靠的依据。此外,至今尚缺乏适用于肉毒毒素的快速检测方法。因此,建立可用于临床样本中多种血清型肉毒毒素区分与活性测定的高灵敏方法依然是待研究的重点和难点。本学位论文针对上述难点问题,围绕七种血清型肉毒毒素,构建基于其特异酶切活性的LC-MS/MS（MRM）检测方法。针对主要引起人类肉毒中毒的A、B和E三种血清型,结合特异性抗体偶联免疫磁珠一步法富集技术,实现了复杂基质中BoNT/A/B/E的高灵敏鉴定、血清型区分以及活性测定;在此基础上,构建可用于A-G七种血清型同时区分检测的稳定同位素稀释内切酶质谱法;最后,方法应用于近三年送检的食源性肉毒中毒病例的临床样本分析,为临床诊断治疗提供了及时有效信息。此外,本论文还建立了基于SERS-免疫夹心策略的肉毒毒素及活性蓖麻毒素的高灵敏快速检测方法。本论文分为五章:第一章为前言,首先概述了肉毒毒素的产生、结构与血清型分类以及毒性作用过程,着重介绍其特异酶切活性;其次,论述肉毒中毒的临床表现特征、鉴别诊断现状以及临床治疗方法;此外,介绍了肉毒毒素的医疗用途,以及与其相关的军事及生物恐怖袭击事件;继而重点概括阐述肉毒毒素的分析检测现状。最后,提出本论文的立题依据与主要研究内容。第二章,基于肉毒毒素的特异酶切活性,构建复杂基质中BoNT/A/B/E的内切酶质谱检测方法。采用合成的底物肽模拟各血清型BoNT在体内的靶蛋白,针对BoNT在各自特异的位点酶切底物所形成的产物肽,采用LC-MS/MS（MRM）进行检测。通过高亲和力底物肽筛选、产物肽的LC-MS/MS（MRM）检测方法以及酶切体系的优化,实现了 BoNT/A/B/E的精确区分以及准确定量。选取一株高特异性抗体mAb 01-3偶联制备免疫磁珠用于一步法富集BoNT/A/B/E,解决了复杂基质中BoNT浓度低、基质干扰大且前处理过程复杂等难以高效特异捕获靶标毒素的难点问题。血清中BoNT/A、B和E检测的LOD值分别为0.5 U/mL、1.5 U/mL和1.8 U/mL,且各血清型之间无干扰。方法成功应用于多起可疑肉毒美容针剂中毒事件的检测,为BoNT美容中毒的临床诊断及救治提供依据。第三章,建立基于稳定同位素稀释的内切酶质谱法同时检测BoNT/A-G。选取各血清型特异性底物肽,建立底物肽组合。采用各型酶切产物肽的稳定性同位素标记肽作为内标,经验证各产物肽的LC-MS/MS（MRM）方法定量灵敏且准确,满足生物样本分析方法学要求。通过提取B oNT/A-G酶切产物肽特异的MRM离子对以及进行保留时间匹配,可实现七种血清型的精确区分及活性测定,方法特异性强。方法的建立为人类及动物中毒的临床样本及相关环境样本,提供了简便有力的检测方法。第四章,方法成功应用于2019-2022年我国17例疑似肉毒中毒病例的63份临床样本分析。我们对病人的血清、尿液、呕吐物、死者的血液和胃粘膜样本以及食物样本进行了全面的检测和分析,其中共检出11例BoNT阳性,并对阳性临床样本中BoNT的血清型进行了精确区分。在此过程中,首次鉴定以E型为主的ABE型混合肉毒中毒病例。重点围绕该四例来自同一家庭的混合型肉毒中毒病例,详细探讨其样本检测结果及其与临床症状发生发展之间的关系。结果显示样本中检出的BoNT浓度水平、血清型与病人的临床症状表现一致;血清中BoNT/A的检测时间窗达12天,首次揭示尿液中检测时间窗可长达25天,为肉毒中毒的临床样本采集类型和采集时间提供了重要依据。揭示了所建立的高灵敏度和高特异性的内切酶质谱法,适用于肉毒中毒尤其是混合型中毒病例检测,可为及时诊治提供重要依据。第五章,构建了一种基于SERS-免疫夹心的活性蓖麻毒素及肉毒毒素快速检测方法。偶联毒素特异性抗体的免疫磁珠作为捕获元件可对复杂基质中毒素实现快速分离和富集,标记毒素单抗及拉曼报告分子NBA（Nile blue A）的金纳米粒子（AuNPs）既作为识别元件亦作为SERS纳米探针。基于抗原-抗体特异性识别,最终可形成“免疫磁珠-毒素-SERS纳米探针”的三明治夹心免疫复合物,以NBA的特征拉曼位移591 cm-1处的SERS信号指示毒素的存在及浓度。首先以蓖麻毒素为模型建立该方法,选取一株可识别蓖麻毒素活性的特异性单抗作为捕获抗体,实现对PBS和血浆中蓖麻毒素的高灵敏检测,其LOD值分别为1 ng/mL和5 ng/mL。建立的方法可区分活性与非活性蓖麻毒素,并实现了蓖麻毒素与其高度同源性蛋白例如RCA120、相思子毒素及AAG的良好区分。进而将策略应用于肉毒毒素检测,选取BoNT/A的高亲和力纳米抗体构建SERS纳米探针,检测PBS溶液中BoNT/A的LOD值低至20 U/mL,方法快速灵敏。该部分研究为肉毒毒素、蓖麻毒素及其他生物毒素的检测及公共安全威胁评估提供了一种新的基于SERS的研究策略。