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第一部分HOXC8基因在MLL重排急性白血病中的表达研究目的:伴有混合系白血病-1（mixed lineage leukemia-1,MLL1）基因重排的急性白血病大多伴有HOXC8基因调控异常。为了探讨MLL基因重排急性白血病中Ash2蛋白对靶基因HOXC8的组蛋白甲基化调控作用,我们检测了两种MLL基因重排急性白血病细胞系（RS4:11和THP-1细胞）中同源盒基因（homeobox gene,HOX）—HOXC8的表达情况。方法:采用实时定量逆转录PCR技术、SYBR Green荧光染料法检测RS4:11和THP-1细胞中HOXC8的mRNA表达水平,运用循环阈值（cycle threshold,Ct）比较法进行相对定量分析,上述基因的相对表达量以公式2（-△Ct）表示。结果:HOXC8基因较高水平表达在两种MLL重排细胞系中,HOXC8在RS4:11细胞中表达更稳定。结论:HOXC8属于MLL调控的靶基因,本研究中HOXC8高表达的实验数据为我们后续的组蛋白甲基化研究奠定了基础,HOXC8在MLL重排急性白血病中潜在的调控机制在第二和第三部分有待验证。第二部分MLL重排急性白血病中siRNA干扰ASH2L基因后HOXC8基因启动子区H3K4三甲基化修饰目的:在MLL重排急性白血病中,单独MLL1融合蛋白只有极低的酪氨酸甲基转移酶活性催化组蛋白H3的第4赖氨酸（H3K4）三甲基化。为探讨含SET1功能域的蛋白复合物（complex proteins associated withSetl,COMPASS）中的另一成员-ASH2L是否对HOXC8基因启动子区有直接或间接的甲基化修饰作用,我们通过敲除ASH2L后分析HOXC8启动子区的组蛋白H3的第4赖氨酸（H3K4）三甲基化。方法:采用siRNA干扰MLL重排急性白血病细胞（RS4:11和THP-1细胞系）ASH2L基因后,染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,CHIP）联合实时定量PCR技术（real-time PCR,RT-PCR）分析HOXC8启动子特异性位点以及RBBP5、WDR5、MLL基因和核小体重塑因子最大的亚单位植物同源结构域（plant homeodomain,PHD）finger 转录因子（bromodomain and PHD finger transcription factor,BPTF）的表达。结果:ASH2L基因敲除后,HOXC8基因和蛋白水平随之下调,RS4:11细胞中HOXC8启动子区（promoter）-3K和转录起始区域的H3k4me3的修饰有明显的减少;THP-1细胞中HOXC8启动子区-3k、-2k和第一内含子1.4k区域的H3k4me3的修饰都有明显的减少（P<0.05）。SiRNA干扰ASH2L后,在RS4:11细胞中,BPTF在HOXC8的启动子区-1.4k、+2k、+3k的3个位点的结合均减弱（P<0.05）;RbBP5在HOXC8的启动子区-1.4k、+2k、+3k、Ok的4个位点的结合均减弱（P<0.05）;WDR5在HOXC8的-1.4k、+2k的2个位点的结合均减弱（P<0.05）;MLL在HOXC8的-1.4k、+2k的2个位点的结合都有减弱（P<0.05）。在THP-1细胞中,siRNA干扰ASH2L后,BPTF在HOXC8的启动子区-1.4k和+3k的2个位点的结合均减弱（P<0.05）;RBBP5在HOXC8的启动子区-1.4k和+3k的2个位点的结合减弱（P<0.05）。结论:以上实验结果显示,在MLL重排急性白血病中,ASH2L不能单独执行甲基转移酶的功能,可能需要通过COMPASS复合物中的其他成员和染色质重塑因子BPTF相互作用激活HOXC8基因。第三部分ASH2L和其他调控蛋白在MLL重排急性白血病中的相互作用机制研究目的:前两部分的研究我们证实了在MLL重排急性白血病中,ASH2L和HOXC8基因的组蛋白甲基化有相关性,我们将继续研究ASH2L和MLL甲基化酶复合物中的其他调控蛋白在MLL重排急性白血病组蛋白甲基化中的作用关系。方法:针对MLL1、WDR5、RBBP5、BPTF基因,我们筛选出最佳的MLL1-C、WDR5、RBBP5、BPTF siRNA干扰片段。针对ASH2L与这些调控蛋白的作用研究采用RT-PCR和western blot检测技术。结果:除了 ASH2L,WDR5、RBBP5、MLL1 和 BPTF 蛋白对 HOXC8 基因的表达也有影响。RS4:11细胞在沉默ASH2L后WDR5和RBBP5蛋白水平都分别出现明显下调（P<0.05）,虽然MLL蛋白水平也有下调趋势,但没有统计学意义（P>0.05）。结论:由于野生型MLL1蛋白在MLL重排急性白血病中只能对靶基因发挥很弱的作用,WDR5可能代替了 MLL1执行主要的甲基转移酶修饰的功能。我们推测ASH2L可能和RBBP5形成异源二聚体的稳定结构,进而通过和WDR5的有序结合,采用协同作用的方式进一步放大组蛋白修饰作用,以调控靶标HOXC8基因H3K4的超甲基化。