【摘 要】
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研究目的:复发性流产是一种病因复杂的妊娠并发症,困扰全球约1-5%育龄期女性,目前尚缺乏有效治疗手段。其中,滋养层细胞功能失调是不明原因复发性流产发生及发展的的主要机制之一,基于对其功能调控的分子机制的研究可为探索新型治疗方式提供新的思路和理论基础。Sprouty 4（SPRY4）是一种肿瘤抑制因子,在多种肿瘤中发挥细胞活性抑制作用。然而,SPRY4在调节母胎界面滋养层细胞功能中所发挥的作用知之甚
【基金项目】
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国家重点研究发展计划（2018YFC1002803,2018YFC1004602）； 国家自然科学基金（81974243,81601291,81971403,81125004）；
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研究目的:复发性流产是一种病因复杂的妊娠并发症,困扰全球约1-5%育龄期女性,目前尚缺乏有效治疗手段。其中,滋养层细胞功能失调是不明原因复发性流产发生及发展的的主要机制之一,基于对其功能调控的分子机制的研究可为探索新型治疗方式提供新的思路和理论基础。Sprouty 4（SPRY4）是一种肿瘤抑制因子,在多种肿瘤中发挥细胞活性抑制作用。然而,SPRY4在调节母胎界面滋养层细胞功能中所发挥的作用知之甚少。本课题通过分析临床疾病样本及体外细胞功能学实验探究SPRY4在母胎界面滋养层细胞基因表达、功能调控中发挥的作用,进一步阐述复发性流产的潜在发病机理。研究方法:采集复发性流产及6-12周正常妊娠人工流产患者的绒毛样本,使用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）,蛋白质印迹法（Western blot）,免疫组化,组织免疫荧光等方法检测母胎界面中SPRY4的基因表达差异;通过免疫组化染色增殖相关指标Ki67,凋亡相关指标cleaved-Caspase3,及TUNEL法检测细胞DNA降解片段量衡量绒毛滋养层细胞增殖及凋亡情况;建立HTR8/SVneo（HTR8）细胞系体外滋养层细胞培养模型,使用小干扰RNA技术敲除或慢病毒转染过表达SPRY4基因,通过CCK8增殖实验、Ed U、荧光双染、流式细胞术等实验研究SPRY4对滋养层细胞增殖、凋亡的影响;采用基因芯片和生物信息学方法探寻SPRY4基因可能调控的下游靶分子及相关信号通路,通过Western blot、细胞免疫荧光、免疫组化等实验研究SPRY4基因调控滋养层细胞功能的分子机制,并对临床样本SPRY4及磷酸化STAT1的表达做相关性分析,进一步通过细胞功能实验验证上述分子机制;使用PI3K/AKT抑制剂GDC-0941作用于IFN-γ处理的HTR8细胞,通过Western blot检测抑制剂对SPRY4、STAT1及磷酸化STAT1的影响,探究调控SPRY4表达的上游分子及相关通路。研究结果:复发性流产患者绒毛组织滋养层细胞中SPRY4基因的表达水平较正常对照组患者显著升高;SPRY4表达升高可导致滋养细胞增殖减少、细胞凋亡活跃,敲减SPRY4后则可促进滋养层细胞增殖,减少细胞凋亡;同时可见,复发性流产患者绒毛组织与正常对照组相比,增殖明显减弱,且凋亡增多;IFNg可通过PI3K/AKT通路促进SPRY4的表达及STAT1的活化;SPRY4可通过激活IFN-γ诱导的STAT1表达及活化抑制滋养细胞增殖、促进其凋亡;复发性流产组织滋养层细胞中磷酸化STAT1表达升高,且其表达水平与SPRY4水平呈正相关。结论:SPRY4可通过激活IFN-γ诱导的STAT1表达及活化抑制滋养细胞增殖、促进其凋亡,IFN-γ可通过PI3K/AKT通路促进SPRY4的表达及STAT1的活化,SPRY4与磷酸化STAT1基因表达升高可能与复发性流产的发生密切相关。
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