前言胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在我国居各类恶性肿瘤之首。近年来的研究表明，胃癌的发生发展是一个多基因参与的多阶段过程。肿瘤抑制基因(Tumor Suppressor Gene，TSG)是生物体内细胞增殖、分化和凋亡过程中的负性调节信号之一。细胞周期调控体系对维持正常细胞周期是必需的，而调控体系中关键因子的异常可导致调控紊乱，以致细胞增殖异常，不能及时分化和凋亡、肿瘤发生。目前认为DNA异常甲基化改变是除缺失与突变之外导致抑癌基因表达失活的第三种机制，在肿瘤的发生发展中起着不可忽视的作用。DNA甲基化(methylation)是DNA的一种天然修饰方式，是由DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)催化的加上甲基基团(CH3-)的碱基修饰过程。基因甲基化的过程就是基因表达受到抑制的过程。抑癌基因甲基化以及基因启动子甲基化都与肿瘤的发生密切相关。HMLH1和Rassf1a基因是与肿瘤发生有密切关系的抑癌基因。其甲基化失活将有助于细胞的无限制生长，促进肿瘤的形成。对这方面进行研究有助于揭示细胞周期的调控，并为阐明细胞增殖、分化、癌变等过程提供线索，并且可能为肿瘤的临床诊断、治疗、预后提供理论、实验依据。本实验采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)方法检测癌旁5、3、1厘米组织及胃癌原发灶中hMLH1和RASSF1A基因甲基化水平表达情况。旨在探讨hMLH1和RASSF1A基因甲基化由胃癌旁不同距离至癌原发灶的动态变化；两种基因甲基化在正常组织、癌前病变及癌灶中表达的变化；两基因甲基化与胃癌原发灶病理生物学行为的关系。实验方法研究对象为2006年1月～2006年8月在中国医科大学肿瘤外科手术胃癌患者40例。本实验共选取手术切除后距胃癌原发灶5、3、1厘米的组织块及胃癌原发灶组织块共160枚。所取标本均分为2份，一份即放入-70℃冰箱保存，一份用甲醛固定、石蜡包埋后保存。其中男性30例，女性10例，男女比例为3：1，最大年龄为78岁，最小年龄为29岁，平均年龄61.5±11.65岁。全部病例按UICC新TNM分期标准、日本胃癌处理规约及中国医科大学肿瘤研究所胃癌外科分型进行分期分型，以上病例均经病理诊断证实，所有患者术前均未经术前放疗、化疗等。采用MSP法进行HMLH1和Rassf1a基因启动子区甲基化水平的检测，实验结果采用SPSS 10.0统计软件进行处理，各组间率的比较采用x~2检验、Fisher’s精确概率法检验，检验显著性水准取α=0.05，P＜0.05有显著性意义。实验结果1 40例胃癌病例：胃癌旁5cm组织中hMLH1基因启动子区甲基化阳性率为2.5％(1／40)；胃癌旁3cm组织中hMLH1基因启动子区甲基化阳性率为12.5％(5／40)；胃癌旁1cm组织中hMLH1基因启动子区甲基化阳性率为10％(4／40)；胃癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化阳性率为32.5％(13／40)。胃癌灶旁5、3、1厘米组织甲基化阳性率均明显低于胃癌原发灶，差异具有统计学意义(P＜0.05)。从胃癌癌旁5厘米组织至癌原发灶，随距癌灶距离减少，hMLH1基因启动子甲基化阳性率随之上升，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。2 40例胃癌病例：胃癌旁5cm组织中RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率为5％(2／40)；癌旁3cm组织中RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率为7.5％(3／40)；癌旁1cm组织中RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率为22.5％(9／40)；胃癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率为42.5％(17／40)。胃癌灶旁5、3厘米RASSF1A基因启动子区组织甲基化阳性率均明显低于胃癌原发灶，差异具有统计学意义(P＜0.05)。从胃癌癌旁5厘米组织至胃癌原发灶，随距癌灶距离减少，RASSF1A基因启动子甲基化阳性率随之上升，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。3胃癌癌旁5cm正常组织、癌旁癌前病变组织及胃癌原发灶中hMLH1基因甲基化阳性率分别为0％(0／24)、8.69％(2／23)、32.5％(13／40)。癌旁5cm正常组织hMLH1基因甲基化阳性率低于有癌前病变的组织，二者均明显低于胃癌原发灶，三者间差异具有统计学意义(P＜0.01)。4胃癌癌旁5cm正常组织、癌旁癌前病变组织及胃癌原发灶中RASSF1A基因甲基化阳性率分别为0％(0／24)、17.39％(4／23)、42.5％(17／40)。癌旁5cm正常组织RASSF1A基因甲基化阳性率低于有癌前病变的组织，二者均明显低于胃癌原发灶，三者间差异具有统计学意义(P＜0.01)。5 40例胃癌患者按照转移淋巴结数分为0-7枚组与7枚以上二组，转移达7枚以上组hMLH1、RASSF1A基因甲基化阳性率明显高于转移7枚以下组，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。6 40例胃癌患者按照浸润深度分为未透浆膜与透浆膜二组，透浆膜组hMLH1、RASSF1A基因甲基化阳性率明显高于未透浆膜，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。7 40例胃癌患者按照大体类型、生长方式、分化程度、性别、年龄分组，hMLH1、RASSF1A基因甲基化阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)。结论1．胃癌原发灶中hMLH1、RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率明显升高，hMLH1、RASSF1A基因启动子区甲基化可能是胃癌癌变过程中的重要分子事件。2．hMLH1基因、RASSF1A基因启动子区甲基化在胃癌癌旁5cm正常组织、胃癌癌前病变、胃癌原发灶中表达存在显著差异。3．hMLH1基因、RASSF1A基因启动子区甲基化与胃癌浸润深度、转移淋巴结数相关，但在不同分化成程度、大体类型、生长方式，性别及年龄间无显著差异。4．hMLH1、RASSF1A基因启动子区甲基化检测可以某种程度上作为胃癌筛查与生物学行为评估指标之一。