黑色素小体是一类由黑色素细胞产生用于合成和运输黑色素的细胞器,黑色素小体的正常功能对于保护皮肤免受紫外线辐射伤害是至关重要的。黑色素小体合成及转移功能紊乱可引发系列异常色素沉着问题,如雀斑、黄褐斑和老年斑等。目前,已开展了较多的针对色素异常沉着的药物研发,但治疗效果或安全性能尚不够理想,亟需加强相关研究获得兼具有效性和安全性的新型药物。可有效模拟黑色素小体合成和转移功能的高通量体外模型是高效开展相关药物研究的重要基础。现有模型主要靶向黑色素小体合成途径,缺乏针对黑色素小体转移途径的高效药筛模型,制约了相关研究的开展。本研究即探索建立黑色素小体转移示踪技术,应用高内涵成像分析技术建立针对黑色素小体转移途径的高通量体外药筛模型,并初步开展新型候选药物的筛选研究。本研究拟通过应用黑色素小体相关蛋白的荧光标记方法构建可特异示踪黑色素小体转移过程的体外模型。研究已证明,酪氨酸酶（Tyrosinase,TYR）是黑色素合成的必需酶,并且可定位于黑色素小体膜。本研究即探索构建TYR与荧光蛋白mNeonGreen（MNG）的融合蛋白TYR-MNG的表达载体,通过转座方式在黑色素瘤细胞MNT-1中稳定表达TYR-MNG荧光融合蛋白。通过应用免疫荧光、Western Blotting（WB）和超高分辨成像等方法,本研究证明了 TYR-MNG荧光融合蛋白可用于定位并示踪黑色素小体。本研究进一步对稳定表达TYR-MNG荧光融合蛋白的MNT-1 TYR-MNG细胞进行单克隆化筛选,选择荧光标记黑色素小体比例较高的单克隆细胞作为黑色素小体供体细胞株,命名为MNT-1 TYR-MNG G11（G11）。本研究将G11细胞分别与不同的作为黑色素小体受体细胞的角质细胞系进行共培养,应用流式分析技术分析黑色素小体转移效率。结果显示,角质细胞Ker-CT对黑色素小体具有相对较高的摄取能力,可作为较优的黑色素小体受体细胞。本研究以G11细胞和Ker-CT细胞为基础构建G11/Ker-CT黑色素小体转移细胞模型,并应用不同检测方法对该模型进行验证。免疫荧光分析结果显示,转移至Ker-CT细胞中绿色荧光小体具有黑色素小体特异性,说明TYR-MNG荧光融合蛋白可示踪黑色素小体转移;超高分辨成像分析结果显示,TYR-MNG荧光融合蛋白可以示踪与黑色素小体转移相关的细胞吞噬、胞吐胞吞、膜融合和脱落吞噬等过程;对已有参考药物的评价结果显示,目前常用的曲酸、烟酰胺和白藜芦醇等对照抑黑药物在该模型中可显示出一定的黑色素小体转移抑制效能。通过上述研究,本研究以G11细胞和Ker-CT细胞为基础构建了 G11/Ker-CT黑色素小体转移细胞模型,该模型通过TYR-MNG荧光蛋白可有效示踪黑色素小体的转移过程,可用于相关抑黑药物的筛选评价研究。本研究应用构建的G11/Ker-CT黑色素小体转移细胞模型,结合高内涵成像分析技术建立黑色素小体转移的高通量可视化药筛模型。本研究初步选取一个库容为600个小分子化合物的激酶抑制剂库,应用该模型开展抑黑效能评价。通过多轮筛选,本研究筛选获得具有较优抑黑效果的候选小分子化合物GSK650394、WHI-P258和PD318088,并进一步分析了候选分子的作用机制。分析结果显示,上述3种小分子药物可通过抑制黑色素小体成熟进而影响黑色素小体转移。其中,应用超高分辨成像、延时摄影以及高内涵成像分析等技术,本研究发现GSK650394分子能够促进黑色素小体和溶酶体的互作,进而可高效抑制黑色素小体的成熟和转移。进一步应用体内模型分析显示,GSK650394能有效抑制C57/BL6小鼠的黑色素合成与转移,抑黑效果优于经典美白药物烟酰胺和白藜芦醇。通过上述研究,本研究构建了较高效的黑色素小体可视化转移模型,可有效示踪黑色素小体的成熟和转移过程,并可用于药物高通量筛选。应用该模型,本研究初步筛选获得了小分子化合物GSK650394,其在体内外模型中均表现出较优的抑黑效能。本研究结果可为黑色素小体的成熟转移机制和相关新型药物筛选评价等研究提供重要支持。