【摘 要】
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A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起人和多种动物的高度接触性急性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)划分为通报疫病。非结构蛋白NS1蛋白(nonstructural protein 1,NS
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A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起人和多种动物的高度接触性急性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)划分为通报疫病。非结构蛋白NS1蛋白(nonstructural protein 1,NS1)通过与细胞内的多种宿主蛋白发生相互作用来调节流感病毒的感染过程,是调节AIV致病性的关键因子。为鉴定与H5N6亚型禽流感病毒NS1蛋白有相互作用的宿主蛋白,本研究:1.Strep标签H5N6重组AIV的构建。用RT-PCR扩增HN109病毒的8个基因片段,分别连接到pBD双向转录表达载体。通过点突变技术将NS1基因的77-84位的氨基酸替换成Strep标签。将8个重组质粒共转染293T细胞,拯救出重组病毒株rHN109-NS1-Strep。经测序验证,拯救病毒的8个基因片段与设计基因一致。测序比对与蛋白表达验证Strep标签可以稳定遗传于F5代以内的重组病毒;重组毒株与野生毒株在MDCK细胞上复制水平相似,在小鼠体内复制能力也相似。2.鸭肺原代上皮细胞的分离培养与鉴定。用组织贴块法从24 d SPF鸭胚中分离肺原代细胞,经差速消化法纯化传代,纯化三代后,靶标上皮细胞标识蛋白钙粘蛋白和广谱角蛋白进行免疫荧光检测,显示90%以上细胞表达阳性,因此鉴定为上皮细胞。3.HN109-NS1-strep与鸭宿主互作蛋白的鉴定。重组病毒与野生病毒分别感染鸭肺上皮细胞(MOI=5)。感染24 h后裂解细胞,4℃离心,收集上清经Strep树脂进行NS1互作蛋白的纯化。纯化样品进行Western-blot和质谱鉴定分析。结果共鉴定出36种与NS1有相互作用的宿主蛋白。
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