本研究以金花茶（Camellia nitidissima Chi.）为材料，在本实验室以往的研究基础上，进行如下研究：①金花茶离体再生体系优化，包括花药胚性愈伤组织诱导的优化、金花茶体胚成熟的调控与萌发研究；②金花茶体胚Cn-SERK基因cDNA和DNA克隆；③金花茶体胚Cn-SERK基因启动子克隆；④金花茶Cn-SERK基因启动子5′端不同缺失突变体载体构建，并转化烟草进行其功能验证，为探讨金花茶体胚发育中的Cn-SERK作用机制提供参考。主要研究结果如下：1金花茶离体再生体系的优化1.1金花茶花药胚性愈伤组织诱导的优化以金花茶花药为材料，诱导其分化愈伤组织，结果表明：在4号培养基：2mg/L2,4-D+0.5mg/L KT+1mg/L NAA+50g/L蔗糖+6g/L琼脂的培养基上的花药愈伤组织诱导率最高达到67.10%。诱导出的白色愈伤可以在分化培养中变绿，根据以往的研究经验，可以断定其为胚性愈伤组织。1.2金花茶体胚成熟的调控与萌发该试验研究了不同浓度的ABA，不同浓度的ABA、肌醇、琼脂、蔗糖组合，不同的光质对体胚成熟的作用，在进行成熟培养之后，转入成苗培养基中以体胚变红为指示。结果表明：在经过ABA的单因素处理后，ABA在浓度为5.0mg/L时，处理的效果最好。在不同浓度的ABA、肌醇、琼脂、蔗糖组合的培养基中，诱导体胚成熟的最佳组合为：10mg/LABA+100mg/L肌醇+50g/L蔗糖+6g/L琼脂。将体胚在红光、蓝光、绿光、白光培养之后，转入成苗培养基中生长，发现只有在白光下诱导成熟的体胚才能变红，在其他的单质光中培养的体胚只有极少数变红。在经过成苗培养基培养60d之后，红色的体胚慢慢的变为绿色或者墨绿色，在这些体胚上开始分化产生一些微小叶芽，茎或者是长有根毛的不定根，最后叶芽伸长形成小植株。2金花茶体胚Cn-SERK基因的cDNA全长克隆及生物信息学分析以金花茶体胚为材料，采用RT-PCR以及RACE方法，获得了金花茶体胚Cn-SERK基因的cDNA全长序列，GenBank登录号为：JX123756.1。该基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，其中5′UTR长度为47bp、ORF为1875bp、3′UTR为197bp、poly(A)尾巴为28bp，开放阅读框编码624个氨基酸，将其命名为Cn-SERK。应用生物信息学的方法分析表明：该蛋白质具有蛋白质N端富亮氨酸重复结构的超级家族结构域，亲水、且具有信号肽的跨膜蛋白，裂解成熟位点可能存在于25-26个氨基酸之间，跨膜结构域有5个，定位于内质网的可能性最高，达到0.685。蛋白的二级结构无卷曲螺旋结构，主要有α螺旋和无规则卷曲构成，存在一个蛋白激酶位点。此蛋白可能发生丝氨酸磷酸化位点的有16个，酪氨酸和苏氨酸磷酸化位点各5个。3金花茶体胚Cn-SERK基因DNA序列的克隆以金花茶体胚DNA为模板，克隆得到了金花茶体胚Cn-SERK基因DNA序列，ATG和TGA分别为起始密码子和终止密码子，该基因ORF的DNA序列全长为8593bp。内含子分析表明Cn-SERK基因由11个外显子和10个内含子组成，且每个内含子的剪切位点符合GT-AG规则。使用PlantCARE软件分析内含子序列，发现在内含子中含有类似启动子中的顺式元件，且都具有核心启动子元件CAAT-Box。内含子中的调控元件可能对基因的特异性表达有调控作用，可能影响转录的起始和延伸并且可能具备较强的启动子功能，在小麦、茶树、老鼠、人等生物上也有类似报道。4金花茶体胚Cn-SERK基因启动子的克隆采用连接介导染色体步移法克隆金花茶体胚Cn-SERK基因启动子，得到Cn-SERK基因启动子的长度为596bp，在线预测位置336-386处为基础启动子区域，可信度达0.97，序列为：5′-AAGCAAAGCATAAAAAAGTTGCAGAGCAGATACAACAACAACCGATTAGG-3′，转录起始位点预测在377bp处的A。用PlantCARE软件发现了该序列的一些元件，其中有核心启动子元件TATA-Box(22处)和CAAT-Box(10处)，该序列基本可以推断认定为其含有基础启动子区域。与高转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch（3处），与厌氧反应有关的顺式作用元件ARE（1处），部分光响应元件AT1-motif（1处），部分包含光响应的保守DNA元件ATCC-motif（1处），真菌诱导响应元件Box-W1（1处），MYB结合位点MBS（1处），光响应元件Sp1（1处），部分光响应元件I-box（1处）、TCCC-motif（1处），生长素响应元件TGA-element（1处），未知功能元件3个（5处）。5金花茶Cn-SERK基因启动子5′端不同缺失突变体载体构建与功能验证试验采用金花茶Cn-SERK基因5′端缺失突变启动子取代pCAMBI1301上的CaMV35S启动子，与GUS报告基因融合，构建含GUS基因的植物表达载体，检测其在烟草植株中的表达情况，分析影响启动子表达的因素，最终确定启动子中缺失片段的功能。以克隆得到的启动子片段为模板，选用XbaⅠ和NcoⅠ为缺失片段上下游的酶切位点，扩增目的缺失片段。使用pCAMBI1301质粒为载体，通过对质粒的双酶切、缺失片段与质粒的连接，构建Cn-SERK基因启动子5′端不同缺失突变体的载体，并对重组质粒进行检测，证实缺失片段已与质粒连接。将验证后的重组质粒转化到农杆菌LBA4404中，进行PCR检测，以带有目片段的农杆菌制作侵染烟草的菌液。将烟草切成0.5cm的矩形小叶盘，放入农杆菌液中侵染，在黑暗条件下培养2d，之后用GUS工作液染色、脱色、拍照，在烟草叶盘受伤的部位变为蓝色。脱色的烟草叶片变蓝说明缺失片段已经转入烟草中且转入的启动子缺失片段具有活性。试验结果表明缺失片段1具有启动子活性，而缺失片段2、3没有启动子活性。