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背景与目的食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,河南是中国乃至世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区。食管癌按组织学可分为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)、食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)、腺鳞癌和未分化小细胞癌等,我国食管癌患者中90%以上是ESCC,而EAC及其他类型的食管癌不足10%,这与欧美国家以EAC为常见病症的特点有所不同。迄今,ESCC的病因尚未完全明确,因其发病隐匿,大多数患者确诊时已属中晚期,且ESCC发病后进展快速,易发生肿瘤的转移和化疗耐受,因此ESCC患者的5年生存率只有不到20%。而得益于过去几十年医学技术上的进步与发展,曾经致死率很高的肿瘤如恶性黑色素瘤和白血病,其五年生存率也已超过50%,因此食管鳞癌目前仍然是全球最致命的癌症之一。Mena是由ENAH基因转录翻译得到的细胞骨架调节蛋白,属于Ena/VASP蛋白家族的一员。Ena/VASP蛋白家族成员均具有两个特殊结构域,分别是在其N端的EVH1结构域和C端的EVH2结构域,而Mena除了具有EVH1和EVH2结构域之外还存在一个Mena特异性的LERER结构域,并且不同于其他Ena/VASP蛋白成员,Mena的mRNA存在着丰富的可变剪接,这导致Mena蛋白存在诸多亚型。多项研究显示Mena在多种人类肿瘤中高表达,如乳腺癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、胰腺癌等,其肿瘤组织相较于癌旁组织均有着高表达的Mena蛋白,同时也有研究显示Mena的高表达与肿瘤的转移及恶性程度高度相关。尤其是在针对乳腺癌的研究当中,已明确证实了 Mena具有促进肿瘤侵袭转移的作用。在食管鳞癌中,肿瘤的转移是导致绝大部分ESCC患者死亡的原因,但到目前为止,仍没有关于Mena在食管鳞癌中的研究。为了探究Mena这一促进肿瘤侵袭转移的蛋白在ESCC中所起到的作用,本实验通过(1)比较27对ESCC肿瘤组织和相应的癌旁组织中MenamRNA的表达情况;(2)检测ESCC细胞系和食管上皮细胞中Mena蛋白的表达差异,并比较Mena表达水平不同的ESCC细胞的生物学特性,具体包括细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭及迁移能力;(3)通过构建Mena特异性siRNA和Mena表达质粒来分别下调和升高Mena的表达水平从而明确Mena对ESCC细胞增殖能力、克隆形成能力、侵袭及迁移的影响;(4)Mena-siRNA和过表达质粒干预Mena的表达后检测EMT相关分子标志物(E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinas,MMP-2、MMP-9)和PI3K/AKT信号通路中关键分子(Akt、p-Akt)的表达,共四个部分来探究Mena对ESCC细胞增殖能力、克隆形成能力、侵袭及迁移能力的影响及其分子机制,以此来明确Mena在ESCC的发生发展中所起到的功能,同时也为发现ESCC肿瘤转移及其预后评价的分子标志物提供新思路。方法1食管鳞癌病人肿瘤组织和癌旁组织中Mena mRNA表达水平的比较于2015年-2016年在安阳市肿瘤医院收取食管鳞癌病人的肿瘤组织及癌旁组织并提取组织总mRNA,通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,qPCR)检测肿瘤组织和癌旁组织中MenamRNA的表达水平。2 ESCC细胞系和食管上皮细胞中Mena蛋白表达水平的比较Western blot检测不同ESCC细胞和食管上皮细胞中Mena蛋白的表达情况。并选择Mena表达水平不同的ESCC细胞来进行后续实验。3 Mena表达水平不同的ESCC细胞生物学特性的比较分别采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验检测高表达Mena的ESCC细胞系(TE13)和低表达Mena的ESCC细胞系(TE1)在增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力上的差异。4 Mena-siRNA下调TE13细胞中Mena的表达通过将Mena-siRNA转染进TE13细胞来敲低Mena的表达。CCK-8法比较siNC组和siMena组细胞增殖能力的变化并绘制生长曲线;平板克隆形成实验比较二者的克隆形成能力;划痕实验和Transwell实验比较二者的迁移和侵袭能力;Western blot 检测二者 EMT 标志物 E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9以及Akt和磷酸化Akt的表达变化。5表达质粒上调TE1细胞中Mena的表达构建Mena表达质粒,空载质粒为对照。转染TE1细胞来升高其Mena的表达水平,CCK-8法比较转染了空载质粒(Control组)和转染了 Mena表达质粒(Mena组)的细胞在增殖能力上的变化并绘制生长曲线;平板克隆形成实验比较二者的克隆形成能力;划痕实验和Transwell实验比较二者的迁移和侵袭能力;Western blot 检测二者 EMT 标志物 E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9、Akt和磷酸化Akt的表达变化。6统计学处理实验数据采用统计学软件SPSS 21.0进行分析处理。对于服从正态分布的两组独立样本均数间比较采用独立样本t检验;针对配对样本采用配对样本t检验;多组间采用单因素方差分析进行比较;P<0.05表示具有统计学差异。结果1 Mena mRNA在食管鳞癌病人肿瘤组织和癌旁组织中的表达在收取的27对肿瘤组织和癌旁组织中,有22对(81.5%)表现为肿瘤组织的Mena mRNA表达水平高于对应的癌旁组织(P<0.05)。2 ESCC细胞系和食管上皮细胞中Mena蛋白表达水平的比较ESCC 细胞 TE1、TE13、KYSE70、KYSE450、KYSE510 中 Mena 的表达水平均高于食管上皮细胞Het-1A,ESCC细胞中TE13的Mena表达水平最高而TE1的表达水平最低。3 Mena表达水平不同的ESCC细胞生物学特性的比较TE13细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力明显强于TE1(均P<0.05)。4 Mena-siRNA下调TE13细胞中Mena的表达用Mena-siRNA下调TE13细胞中Mena的表达后,细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力均被减弱(P<0.05);下调Mena的表达后可以抑制TE13细胞EMT,表现为siMena组细胞的N-cadherin、Snail和Slug表达均低于siNC组(P<0.05);下调Mena的表达后PI3K/Akt信号通路被抑制,表现为siMena组细胞的Akt及p-Akt的表达水平均低于siNC组(P<0.05);相较于siNC组的细胞,siMena组细胞的MMP-2和MMP-9的表达被明显抑制(P<0.05)。5 Mena表达质粒上调TE1细胞中Mena的表达水平用Mena表达质粒上调TE1细胞中Mena的表达后,细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力均得到增强(P<0.05);上调Mena的表达后可以促进TE1细胞EMT,表现为相较于Control组的细胞,Mena组细胞中E-cadherin表达下降(P<0.05)而 N-cadherin、Snail 和 Slug 表达升高(P<0.05);上调 Mena的表达后,Mena组细胞的Akt及p-Akt的表达水平均高于Control组(P<0.05);同时,相较于转染了空载质粒的TE1细胞,转染了 Mena表达质粒的TE1细胞其MMP-2和MMP-9的表达均得到升高(P<0.05)。结论1 Mena在ESCC肿瘤组织和细胞系中的表达水平显著高于癌旁组织和食管上皮细胞。2Mena通过影响ESCC细胞PI3K/Akt信号通路、MMP-2和MMP-9的表达以及EMT来调控ESCC细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移。