论文部分内容阅读
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,简称GOD)能催化β-D-葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和过氧化氢,具有去葡萄糖、除氧、抑菌、产葡萄糖酸等功效,广泛应用于食品、饲料、医药、纺织等各大领域。目前,工业上主要通过黑曲霉、青霉属菌株来生产葡萄糖氧化酶。它们产生的GOD主要分布于胞内、胞壁之中,纯化过程损失大,产率较低。丝状真菌里氏木霉具有蛋白表达量大、胞外分泌率高等优良特性,利用基因工程技术在里氏木霉中表达葡萄糖氧化酶是实现该酶高效率生产的有效途径。本文依据里氏木霉密码子偏好性对黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行密码子优化。将合成的GOD编码序列嵌入里氏木霉强启动子(含信号肽)Pcbhl-ss、终止子Tcbhl之间构成完整的表达盒,并与潮霉素B抗性标记一同构成最终表达载体pCB-GODo该质粒载体经农杆菌介导转化至里氏木霉细胞中进行表达,共得到45株阳性转化子。通过双层平板筛选法对里氏木霉转化子进行初筛,确定蓝色圈直径最大的4株转化子进行摇瓶复筛,获得性能优良的重组里氏木霉T.reesei ZU-G3。该菌株72h发酵液中的GOD酶活高达100.20U/mL。用SDS-PAGE检测重组里氏木霉发酵液可得到约80kDa的葡萄糖氧化酶条带。将转化子重复传代培养10个批次后,提取染色体DNA进行PCR验证,可检测到约1.7kb的葡萄糖氧化酶基因条带,说明该基因已稳定地整合到里氏木霉基因组中。从蛋白质及分子层面进一步验证了葡萄糖氧化酶已成功实现异源表达与胞外分泌。通过单因素实验对里氏木霉发酵培养基成分及发酵条件逐一进行了优化。最终得到优化后的里氏木霉发酵培养基(1L)：乳糖20g,微晶纤维素20g,蛋白胨9g, (NH4)2SO4 2.8g, KH2PO4 4g, MgSO4-7H2O 0.6g, CaCl2 0.6g,微量元素2mL。优化后的最适发酵条件为28℃、pH 5.5。采用优化后的发酵培养基,在最适发酵条件下摇瓶产酶72h,葡萄糖氧化酶活力最高,达到154.87U/mL,约是优化前GOD活力的1.5倍。研究了重组里氏木霉ZU-G3发酵所得葡萄糖氧化酶的酶学性质,发现葡萄糖氧化酶的最适反应温度、pH分别为40℃、pH5.5。当温度在20～45℃的范围内时,酶的稳定性较为理想,水浴保温1h后仍保留超过85%的酶活力。将酶置于微酸性环境(pH 5.0～6.5)中保存24h,其酶活仍保留愈80%,稳定性较好。金属离子对酶活性的影响各不相同,Ca3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+离子能不同程度地促进葡萄糖氧化酶的活性,Pb2+、Ag+、Fe2+离子则抑制作用明显。而K+、Na+、 Mg2+离子对GOD酶活基本没有影响。本课题实现了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的重组与表达。相关研究成果对丝状真菌基因重组表达体系的构建具有重要意义,为葡萄糖氧化酶的规模化生产及工业化应用奠定了坚实的基础。