[背景]重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）在治疗神经退行性疾病方面显示出巨大的潜力。然而,血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的存在阻碍了病毒载体的有效传递。通过开颅定向注射是实现rAAV转染最常用的方法,但这增加了颅内感染和其他并发症的风险,使得其临床应用受限。目前研究表明,低频聚焦超声（focused ultrasound,FUS）联合微泡技术可无创地开放血脑屏障,靶向转运药物入脑组织。在此基础上,为了进一步探讨影响脑内rAAV生物活性和选择性的主要因素,阐明多次开放BBB和联合用药方案对脑组织的作用机制,本研究拟应用磁共振引导聚焦超声爆破载药微泡,开放大鼠皮层运动区处血脑屏障。通过比较实验各组的超声辐照强度-时间-机械指数,观察神经细胞超微结构和脑组织形态的变化,检测脑内外rAAV转染后蛋白表达浓度,用以评估改变血脑屏障通透性的可行性与安全性,为临床无创、靶向基因传递治疗脑部疾病提供理论基础。[目的]1.探讨采用不同的声学参数（声压强度-辐照时间-机械指数）开放血脑屏障的可行性,初步确定无创、有效开放血脑屏障的关键参数。2.运用聚焦超声作为可精确定位、暂时且可复性开放血脑屏障的技术,实现向活体内靶向投递rAAV,应用分子成像方法探索基因治疗的传递机制。[方法和技术路线]1.聚焦超声联合微泡暂时开放血脑屏障的安全性及可复性评价:利用聚焦声波设备仪测定超声探头的声学相关参数,筛选出安全、有效的开放单侧BBB的机械指数和声压范围,为研究声波引发的空化效应提供具体量化标准;脑组织的石蜡切片行HE染色,观察脑组织的病理变化,客观评价脑损伤的程度和等级。采用水迷宫实验进行实验动物的神经功能行为学评价,以及超声辐照治疗前后神经功能行为影响及变化趋势的综合评价。2.伊文思蓝（Evan’sblue,EB）示踪实验:各实验组动物分别给予相应的超声辐照30分钟后,经左心室全身灌注后取出脑组织,称重、浸入甲醛溶液、淬取。用DU800紫外分光光度计测定EB溶液最大吸收峰处的光密度。采用ImageJ软件对EB渗出区进行图像分析,通过套索工具选择超声波区域、划定面积,测量显示正信号的像素数。选取辐照中心载玻片,将EB渗出面积表示为百分比面积（EB渗出面积/全脑面积× 100%）。3.探讨聚焦超声联合微泡增加血脑屏障通透性的机制:应用免疫组化技术,在超声处理后1、2、4、6和24h检测紧密连接（Tj）特异性跨膜蛋白Occludin、Claudin-5和膜下ZO-1的分布。定量评估蛋白质的表达一计算每微米的免疫信号在连接裂缝的数量。大鼠血脑屏障破坏后,免疫荧光检测相关蛋白表达及含量变化,检验这些变化是否与脑微血管紧密连接、血脑屏障完整性有关。4.T1加权MRI增强扫描监测BBB通透性:超声检查后,使用3T MRI系统进行影像学检查。大鼠用1.5%异氟醚和氧气混合麻醉,在整个成像过程中用1%异氟醚维持。射频接收使用直径约4 cm的小环形柔性线圈（Loop Flex Coil;西门子）。采用快速自旋回波序列（fast spin echo,FSE）,进行BBB开放成像（重复时间/回波时间=435/12毫秒;矩阵=154 × 256;层厚=1.5 mm）,获得20层T1加权MRI图像,覆盖全脑。成像平面位于焦区中心,垂直于超声波束轴线。在超声治疗之后大约1 min尾静脉注射磁共振成像对比剂-钆喷酸葡胺（1 mmol/kg）,且于注射后60 min分析MRI增强情况,描述对比度增强空间分布的等高线图、量化BBB开放程度。5.聚焦超声联合微泡辐照促rAAV6-eGFP跨血脑屏障的实验研究:rAAV载体在突触素启动子的控制下,分别用rAAV6表达GFP。病毒载体滴度由生产厂家提供（实时定量）,在磷酸盐缓冲液中稀释至1.1×1012GC/ml。每只大鼠（平均体重120g）加入100 μl稀释的rAAV与～2.5×107个微泡混合,经尾静脉注射。转染3周后处死大鼠,经心脏灌注磷酸盐缓冲盐水、随后多聚甲醛。脑组织行冠状切片后免疫组织化学染色,用抗GFP抗体行DAB法染色。为了鉴定rAAV转导的细胞类型,还需进行免疫荧光染色。脑切片与一抗孵育:大鼠抗NeuN（1:200稀释度）和兔抗GFP（1:200稀释度）。然后用荧光标记的羊抗鼠抗体和山羊抗兔抗体进行染色。用共聚焦激光扫描显微镜获得荧光图像。6.行为学测试评估BBB开放和rAAV转运投递的安全性:Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）实验。所有大鼠每天训练4次,连续训练5 d。训练期间,隐蔽平台的位置是固定的,并提供空间线索进行引导。在每一次训练试验中,将大鼠放入4个起点之一面向墙壁的水中,并给予60 s的时间到达隐藏的平台。找到平台后,让大鼠在平台上停留10s。使用智能视频跟踪系统记录游泳速度、游泳路径、在每个区域花费的时间和游泳距离。[结果]1.在不同超声功率、辐照时间作用下,向大鼠体内注入相同剂量微泡,每单位质量脑组织中钆对比剂/EB的平均渗出量,随超声功率和时间的增加而增加。由于MR对比剂渗透过BBB,随后T1加权MR图像上的局部增强区域证实了BBB成功开放。虽然,EB漏出到BBB破坏部位的脑实质中,但在HE染色切片内相应位置未观察到微血管破裂或红细胞外渗。2.光镜和透射电镜下显示MBs介导的聚焦超声辐照后,各实验组样本脑细胞表面无明显损伤或形态学改变。通过对Occludin、Claudin-5和膜下ZO-1特异性蛋白表达的定量评估,证实了超声作用部位的血脑屏障破坏。在超声作用后1 h和2h观察到这些制剂的渗漏,少数血管在4h观察到渗漏。这些变化与TJ复合物的明显解体平行,表现为Occludin、claudin-5和ZO-1免疫信号的重新分布和丢失。超声作用后6h和24h,这些蛋白表达升高到对照组水平（P>0.05）,免疫信号的定位和密度显示TJ的屏障功能已完全恢复。3.为探讨FUS对记忆和认知功能的影响,大鼠连续5 d（造模后14 d）进行MWM训练。从训练的第一天到最后一天,所有组的逃避潜伏期都与对照组无显著差异。MWM实验中,超声辐照组大鼠的跨越次数（2.98±0.31）和平台区停留的时间（1.21±0.16）与对照组相比（3.37±0.7,1.44±0.32;P>0.05）没有显著差异,且在目标象限花费的时间和运动速度在各组之间同样没有显著差异,提示FUS开放后大鼠的记忆和认知功能未发生显著改变。4.用携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的rAAV6载体,采用650 KHz、1.3 w/cm2、1 min的聚焦超声联合微泡（1 μl/ml）将目的基因导入脑内。所有大鼠在FUS处理后5 min内经尾静脉注射rAAV6-eGFP,12 d后处死。通过共聚焦显微镜直接就可检测到GFP的表达,之后使用抗GFP的抗体进行免疫染色并采用明场和共聚焦显微镜观察以获得最佳的可视化效果,可见GFP表达被增强。在所有接受FUS治疗的大鼠中,目标脑皮层区出现GFP高表达;而在非FUS处理的大脑区域,几乎检测不到GFP表达。[结论]1.联合使用聚焦超声、微泡会引起TJ分子结构解体,从而导致脑微血管连接及屏障功能丧失。优化超声参数可以诱导BBB有效、可调控及安全的开放,同时对正常脑组织的损伤最小;2.静脉注射rAAV结合FUS开放BBB可以在脑内提供有效的基因传递和表达,显示出非侵入性和靶向性基因传递对治疗中枢神经系统疾病的巨大潜力。