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肥厚型心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy,HCM）是由单基因突变所引起的常染色体显性遗传性疾病,其病理特点主要为心肌细胞肥大、排列紊乱、心肌纤维化和结缔组织增生。HCM的发病率为0.2%,是青少年及运动员心源性猝死（Sudden cardiac death,SCD）的主要原因,可在任何年龄段发病,有显著的家族聚集性,家族性发病者占全部患者的50%,年死亡率约为1%~2%。大量数据表明MYBPC3是最频繁发生突变的HCM基因,约占HCM突变的40%~50%。MYBPC3基因突变形式具有多样性,主要分为无义突变、缺失或者插入突变和剪接位点突变等。MYBPC3编码心脏肌球蛋白结合蛋白C（c My BPC）,c My BPC位于粗肌丝两端横桥区,是横纹肌的重要组成部分,通过调节肾上腺激素、连接肌球蛋白分子和肌小节的A带,维持心脏的正常生理反应和肌小节结构的稳定。心肌纤维化（MF）已被证实是HCM发病的重要因素和决定因素。MF是心脏结构和功能改变的常见病理表现,主要表现为心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）增殖和心肌组织胶原过度沉积。纤维生成是机体在损伤后的修复反应,维持组织和器官的结构完整性。然而,过度或不可控的修复过程会导致器官纤维化,在严重情况下,纤维化的发展破坏了正常心脏结构和功能,对人体健康构成严重威胁。然而,目前尚无研究报道MYBPC3基因突变与HCM心肌纤维化的关系。本研究旨在探究MYBPC3基因突变与HCM心肌纤维化的关系及相关分子机制,主要包括以下内容:（1）建立模拟临床MYBPC3点突变的模型猪。运用单碱基编辑系统和体细胞核移植技术（SCNT）,模拟1998年发现的MYBPC3基因的错义突变R495Q,制备基因修饰HCM猪。点突变猪的基因型和表型结果显示,R495Q基因突变显著降低CFs中MYBPC3表达水平;显著升高心肌损伤相关指标（hs-TNT和PCIP）水平、纤维化标志物TGF-β1水平和炎症因子水平,并且心肌组织出现严重的炎症细胞浸润;R495Q基因突变使心肌组织中TGF-β1、COL1A1和α-SMA的m RNA和蛋白表达水平显著升高;Masson染色显示,突变导致严重的心肌纤维化表型;同时,R495Q基因突变使血清和心肌组织的乳酸水平显著升高。（2）探究MYBPC3突变对成纤维细胞活化的影响。首先,确定MYBPC3基因在猪心肌成纤维细胞（PCFs）、小鼠心肌成纤维细胞（MCFs）、小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）以及人心肌成纤维细胞（HCFs）中均表达;使用CRISPR/Cas9基因编辑系统建立MYBPC3基因敲除的成纤维细胞,检测基因缺失对细胞增殖,周期,凋亡以及迁移的影响。结果表明,MYBPC3基因缺失显著提高成纤维细胞的增殖能力,加快细胞周期进程,减少凋亡细胞数量,增强细胞迁移能力;对成纤维细胞活化后纤维化标志物的表达进行检测,结果显示,MYBPC3基因缺失显著升高成纤维细胞COL1A1、α-SMA和TGF-β1的表达水平,并且成纤维细胞内外TGF-β1含量显著升高。（3）MYBPC3基因缺失致心肌纤维化的分子机制。因MYBPC3 R495Q点突变猪血清和组织中乳酸水平显著升高,为了进一步确定糖酵解介导MYBPC3基因缺失导致心肌纤维化,在成纤维细胞中分别检测反应糖酵解通量的细胞内外葡萄糖、乳酸和ATP水平。结果显示,MYBPC3基因缺失显著加快细胞内外葡萄糖消耗,增加细胞内外乳酸的含量,促进细胞内ATP合成;同时,MYBPC3基因缺失显著上调糖酵解途径的关键酶和重要基因的m RNA和蛋白表达水平;显著上调增强糖酵解相关基因GLUT1、PFK、LDHA等转录的HIF-1α的表达,这一结果与糖酵解通量增强相一致。抑制糖酵解途径显著降低MYBPC3缺失上调的纤维化标志基因COL1A1和α-SMA的表达,但不影响TGF-β1的表达。研究发现,HIF-1α和TGF-β1之间相互作用促进纤维化进程。本研究结果显示,在MYBPC3缺失成纤维细胞中,HIF-1α抑制剂Oltipraz显著降低HIF-1α、糖酵解途径以及纤维化标志物基因的表达,但不影响TGF-β1表达;而TGF-β1的抑制剂SB-431542则显著抑制HIF-1α、糖酵解途径以及纤维化标志基因的表达。已知TGF-β1和NF-κB共同参与肝纤维化的发生,本研究结果显示,MYBPC3基因缺失的成纤维细胞中磷酸化p65增加,NF-k B信号通路被活化,PDTC抑制NFk B信号通路的同时,显著降低TGF-β1和HIF-1α表达,而SB-431542对NF-k B信号通路则没有抑制作用。综上所述,我们采用基因编辑技术在模型猪中模拟临床MYBPC3 R495Q基因突变,证明该基因突变导致心肌纤维化;在体外成纤维细胞中,阐明MYBPC3基因缺失激活NF-κB/TGF-β1/HIF-1α/有氧糖酵解信号级联,促进成纤维细胞活化,导致纤维化表型。