关节软骨在人体生理环境中要承受复杂的关节载荷以及周而复始的摩擦运动,因此会不断的磨损和退化,而且关节软骨组织一旦缺损很难实现再生和自修复。传统治疗关节软骨缺损的方法大多都存在不足和局限性,软骨组织工程是目前修复软骨缺损最有希望的方法。一个理想的软骨组织工程支架需具备良好的生物相容性、机械稳定性和大量的孔隙结构特征以满足细胞增殖和营养物质的扩散。3D打印技术因其能实现个性化精确调控的优点已被广泛用于软骨组织工程支架的制备,然而3D打印的传统关节软骨支架多为单层或均质同性,不能精确仿生天然关节软骨组织高度分层、各向异性的结构特征。因此,本文拟基于生物3D打印构建三层梯度定向的水凝胶软骨支架以模拟天然关节软骨的形态结构,从而实现成分的梯度仿生和结构的梯度仿生。首先,基于天然关节软骨浅表层组织中“胶原含量多/蛋白聚糖含量少”的成分仿生理念,制备了一系列明胶（Gt）/海藻酸钠（Alg）水凝胶油墨,并优化出最佳组分7Gt-3Alg作为浅表层软骨支架的打印油墨。结合生物3D打印和模板冷冻定向技术成功构建出7Gt-3Alg浅表层水平定向软骨支架,并与未定向组支架进行性能对比。扫描电镜结果显示7Gt-3Alg水平定向组支架内部具有水平取向的直线型多尺度微孔结构;理化性能测试表明水平定向结构提高了浅表层软骨支架的孔隙率（88.31%）,降低了平衡溶胀率和体外降解率（41.6%）;力学性能测试表明水平定向结构明显改善了浅表层软骨支架的抗拉伸性和粘弹性。其次,考虑到天然关节软骨中间层组织具备较高的抗压能力,将纳米蒙脱土（MMT）添加到Gt和Alg中制备了一系列纳米复合水凝胶油墨Gt-Alg-MMT,并优化出最佳组分2Gt-5Alg-5MMT作为中间层软骨支架的打印油墨。结合生物3D打印和模板冷冻定向技术构建出2Gt-5Alg-5MMT中间层交错定向软骨支架,并与未定向组支架进行性能对比。扫描电镜结果显示2Gt-5Alg-5MMT交错定向支架内部具有交错排列的多尺度微孔结构;理化性能测试表明交错定向结构提高了中间层支架的孔隙率（96.26%）,降低了平衡溶胀率和体外降解率（23.8%）;力学性能测试表明交错定向结构改善了中间层软骨支架的抗压缩性和粘弹性。然后,为了模拟天然关节软骨深层组织良好的抗压缩性和骨传导性,将纳米羟基磷灰石（n HA）添加到Gt和Alg中制备了一系列纳米复合水凝胶油墨GtAlg-HA,并优化出最佳组分5Gt-7Alg-3HA作为深层软骨支架的打印油墨。结合生物3D打印和模板冷冻定向技术成功构建出5Gt-7Alg-3HA深层垂直定向软骨支架,并与未定向组支架进行性能对比。扫描电镜结果显示5Gt-7Alg-3HA垂直定向组支架内部具有垂直排列的多尺度微孔结构;理化性能测试表明垂直定向结构提高了深层支架的孔隙率（94.21%）,降低了溶胀率和降解率（18.2%）;力学性能测试表明垂直定向结构极大改善了深层软骨支架的抗压缩性和粘弹性。随后,选用7Gt-3Alg、2Gt-5Alg-5MMT和5Gt-7Alg-3HA油墨分别模拟软骨的浅表层、中间层和深层,采用生物3D打印和模板冷冻定向技术构建出多层梯度定向仿生软骨支架。设计制备了多组具有不同梯度孔形/孔径结构的多层软骨支架,并优化出最佳组合的梯度孔形/孔径结构。进一步对四种多层软骨支架（均匀未定向组、均匀定向组、梯度孔形定向组、梯度孔径定向组）进行性能对比。理化性能测试表明梯度分布的孔径/孔形结构适当降低了多层软骨支架的孔隙率、溶胀率和降解率,而各层定向异构结构则提高了支架的孔隙率;力学性能测试表明梯度分布的孔径结构和各层定向异构结构均能有效改善支架的抗压缩性、抗蠕变性和自恢复性,而梯度分布的孔形结构对其无显著影响。最后,分别对生物3D打印的单层定向异构软骨支架和多层梯度定向仿生软骨支架进行体外生物学性能评价。通过Live/Dead染色和CCK-8测试表征单层（浅表层、中间层、深层）定向异构软骨支架和未定向组支架的生物相容性,结果表明单层定向组支架内部的有序二级多孔结构更有利于促进ADTC5细胞的粘附和增殖。通过组织切片染色、糖胺聚糖（s GAG）含量的测定以及软骨特异性基因的表达来探究四种多层仿生软骨支架（均匀未定向组、均匀定向组、梯度孔形定向组、梯度孔径定向组）在体外诱导软骨组织分化的能力,结果表明各层定向异构结构对多层仿生软骨支架的增殖分化能力影响较大,而梯度孔形/孔径结构对其无显著影响。