研究背景:下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)是一种恶性肿瘤,属于头颈鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinomas,HNSCC)中的一种。HSCC这种恶性肿瘤发病率比较低:在HNSCC患者中HSCC患者大约仅占了 5%-15%。但是,由于HSCC的患者早期症状不明显,所以诊断为晚期肿瘤的患者数量远多于诊断为早期肿瘤的患者。目前,HSCC的治疗手段依然依赖于手术,术后的放疗,化疗等,然而治疗效果并不乐观。鉴于HSCC具有诊断晚、预后差、治疗方式传统等特点,寻找一些新的与该肿瘤的发生、发展以及预后相关的生物学因子就显得尤为重要。但是由于HSCC发病率低,临床病例资料的收集相对困难,所以相对于其他常见的人类恶性肿瘤,HSCC的相关研究比较少见。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)是近年来发现的一个新的抑癌基因,PDCD4是通过调节其他基因的表达水平来发挥其抑癌基因的作用的。PDCD4可以通过MA-3功能域与真核细胞翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4A,EIF4A)绑定,或者PDCD4本身可以直接与靶基因的MYB/c-MYB编码区结合,从而调节靶基因的转录和翻译,进而影响肿瘤的生长、分化、转移等生物学特点。研究表明,PDCD4在一些肿瘤中表达下调或者表达缺失,包括肺癌、直肠癌、肝癌、神经胶质瘤、乳腺癌等,而且这种表达情况的改变对以上肿瘤的发生和发展起了非常重要的作用。在一些体外实验中还发现PDCD4能抑制肿瘤细胞的生长和侵袭,提高肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。此外还有报道称PDCD4对一些炎症相关的疾病也有影响。最近的一些研究发现,PDCD4是microRNA-21(miR21)的功能特异性的靶基因,PDCD4与miR21之间存在负相关的联系,并且它们很可能作为重要的预后因子影响着多种人类恶性肿瘤。综上所述,PDCD4是一个非常重要的抑癌基因,但是在HSCC中PDCD4发挥着什么样的作用并没有任何的相关研究以及报道,PDCD4很可能对HSCC的发生、发展以及预后产生重要的影响,PDCD4是否能成为HSCC的一种预后因子值得探究。实验目的:本课题的研究目的在于检测PDCD4在下咽鳞状细胞癌肿瘤组织与癌旁非肿瘤组织中的表达情况,研究PDCD4表达高低与下咽鳞状细胞癌患者的临床病理学特征和术后生存情况的相关性,并且研究PDCD4对下咽鳞状细胞癌细胞系FaDu细胞的生物学特征的影响,从而了解PDCD4在下咽鳞状细胞癌的发生和发展中所起的作用以及PDCD4作为下咽鳞状细胞癌预后因子的潜在价值。实验方法:在本课题的研究中,应用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)的方法对66例下咽鳞状细胞癌患者的肿瘤组织和35例癌旁黏膜组织的蜡块标本中的PDCD4蛋白采用免疫特异性的染色,根据染色强度及范围确定IHC评分,以此来衡量PDCD4的表达情况,并用Mann-Whitney秩和检验方法分析下咽鳞状细胞癌蜡块标本中癌组织和癌旁组织里PDCD4蛋白的表达差异。用western blot的方法半定量检测来自于10位下咽鳞状细胞癌患者的新鲜组织样本(包括癌组织及对应的癌旁黏膜组织)中PDCD4蛋白的表达情况,并用配对资料t检验的方法分析相对灰度,以检测PDCD4蛋白在新鲜组织中表达的差异。在体外实验中,以下咽鳞状细胞癌细胞系FaDu细胞系作为研究体系,通过转染的方法构建PDCD4高表达的细胞FaDu-PDCD和对照组细胞FaDu-MOCK。应用活细胞计数的方法以及CCK8(Cell Counting Kit-8)生长曲线的方法检测PDCD4对下咽癌细胞生长及增殖情况的影响;应用transwell的方法检测PDCD4对下咽癌细胞迁移和侵袭特性的影响,在细胞实验的结果分析中应用非配对资料t检验的统计学方法进行两组间统计学差异的比较。此外,我们还统计了患者的临床病理信息以及术后生存情况,用Pearson卡方检验的方法分析了 PDCD4的表达程度与患者临床病理资料包括年龄、病理分级(肿瘤分化程度)、临床分期和淋巴结转移情况的相关性;应用Kaplan-Meier生存分析方法研究了 PDCD4表达高低对下咽癌患者的预后是否存在影响。在实验结果分析过程中,每个实验重复三次以上,所有的统计学差异的分析均使用SPSS 19.0软件进行计算,当双侧检验结果P<0.05时,判定差异具有统计学意义。实验结果:IHC和western blot的实验结果均证明,与癌旁黏膜组织相比,PDCD4基因在下咽鳞状细胞癌的肿瘤组织中表达下调甚至缺失,而且在癌旁正常组织中,PDCD4在细胞核和细胞质中均有表达,但在某些肿瘤组织中PDCD4仅在细胞质中表达。通过将PDCD4表达高低情况与各项临床病理数据进行相关性的分析,我们发现PDCD4的表达情况与下咽癌患者肿瘤分化程度相关。在体外实验中,活细胞计数和CCK8生长曲线研究均表明,PDCD4的高表达可以抑制下咽癌细胞的生长和增殖;在transwell实验中,我们还发现PDCD4的高表达对下咽癌细胞的侵袭和迁移也具有抑制作用。除此之外,生存分析研究发现PDCD4的表达情况还与下咽癌患者的顶后相关:PDCD4的低表达预示着患者的不良预后。实验结论:PDCD4在下咽鳞状细胞癌癌组织中存在表达下调的现象,而且PDCD4对下咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭都有抑制作用,PDCD4的表达情况与下咽癌的分化程度以及患者预后相关。这些结果提示PDCD4在下咽癌的发生和发展过程中起抑癌基因的作用,它能影响癌细胞的生长、分化和转移,而且PDCD4有望成为下咽癌的预后因子,为研究下咽癌治疗的新方法提供启示。