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大丽轮枝菌是一种土传性真菌,寄生范围广,它所引起的棉花黄萎病是一种毁灭性维管束病害,也是我国棉花生产上高质量高品质产出的最主要障碍,给经济造成了巨大的损失;其防控困难,被称为棉花“癌症”。目前,对大丽轮枝菌的致病机理仍不是很清楚,也没有较为理想的病害防治方法。从分子水平上研究其致病机制,筛选和鉴定大丽轮枝菌的致病相关基因,将可为该病有效的防控提供新的途径和思路。内切葡聚糖酶属于植物细胞壁降解酶中的一类,对纤维素的降解起着重要作用。植物病原真菌,包括大丽轮枝菌能产生纤维素酶来促进其对宿主的侵染与定殖,而且大丽轮枝菌中较高的内切葡聚糖酶活性与其侵染能力相关,因此,预测大丽轮枝菌内切葡聚糖酶基因在穿透植物或早期的定殖阶段起着重要作用,可能成为棉花病的一类致病因子。本研究采用RNAi技术研究分析内切葡聚糖酶基因在大丽轮枝菌致病中的作用。利用RNAi技术对内切葡聚糖酶第5、12家族共9个基因进行同时干扰,构建沉默突变株。然后通过对突变株与野生型进行的RT-PCR、菌落形态、生长速度、产孢及侵染能力等方面的分析探讨内切葡聚糖酶基因在大丽轮枝菌致病中的作用,为验证内切葡聚糖酶基因是否为致病基因提供参考,也有利于更好地了解棉花黄萎病菌的致病机理,为防治棉花黄萎病提供新的途径和依据。主要研究结果如下:1、运用生物信息学方法,从大丽轮枝菌基因组数据库中搜索得到Family 5和Family 12两个糖苷水解酶家族9个内切葡聚糖酶目的基因的cDNA序列。并进行序列比对分析,分别选取40 bp的非同源片段,合成一段长为360 bp的目的基因VdF5012。2、建立了高效的大丽轮枝菌基因沉默体系,(1)通过融合PCR方法,得到含eGFP基因的融合片段,并构建得到含eGFP片段的双元载体rh-pPK2;(2)成功构建了目的基因发夹结构沉默表达载体与反向双启动子系统沉默表达载体;(3)通过农杆菌介导的大丽轮枝菌的转化方法(Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation,ATMT),快速高效地得到沉默转化子;(4)通过eGFP基因的PCR验证及绿色荧光信号强度的显微观察对大丽轮枝菌基因沉默转化子的筛选体系进行了优化。3、对野生型菌株、沉默突变株以及表达eGFP蛋白的亲本菌株的一些生理特征进行了比较分析。(1)以真菌18S为内参,通过对eGFP基因及9个目的基因进行半定量RT-PCR分析,结果表明:亲本菌株CK中9个目的基因的cDNA表达水平相对于野生型WT均较低;沉默突变子KD_A5和KD_B3中目的基因沉默效率较高,而KD_B7中基因几乎没有发生沉默效应;(2)将培养好的孢子悬浮液浓度稀释至107个/mL,吸取5 μL点至PDA平板中央,每天测量菌落直径大小发现,基因沉默突变株菌落生长速率较野生型稍有迟缓,亲本菌株与野生型差异不大;(3)吸取200μL浓度为107个/mL的孢子悬浮液,接种于25 mL PDA培养液中,震荡培养(25℃,200 rpm)一周及两周后显微镜下计数,基因沉默突变株的产孢子能力相对野生型及亲本菌株减弱;(4)采用水培法培育棉苗,用浓度为107个/mL的孢子悬浮液浸泡棉苗根部40 min,观察棉苗病情。亲本菌株与野生型侵染的棉苗病症类似,而突变型菌株侵染的棉苗相对于野生型或亲本型菌株侵染的棉苗,病症则相对减弱,且KD_A5和KD_B3侵染的棉苗病情指数较低,说明内切葡聚糖酶基因的沉默影响了大丽轮枝菌对棉花宿主的致病力。