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乳腺癌居我国女性恶性肿瘤发病率的首位,每年死亡率超过7万,已成为女性健康的第一杀手。肿瘤转移是导致肿瘤临床治疗失败的主要原因之一。采用磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphoinositide3-kinase/serine/threonine protein kinase,PI3K/Akt)信号通路抑制剂和化疗药物联合用药,共载于刺激响应性纳米载体,有望为安全、高效抑制肿瘤生长和转移的新策略,但设计和构建安全、稳定和能突破各种生物屏障的刺激响应性纳米载体仍然是具有挑战性的课题。纳米载体递送药物至肿瘤细胞需要克服三个屏障:(i)细胞外(血循环)避免清除、(ii)细胞膜:增加细胞摄取、(iii)内涵体中释放药物并逃逸至细胞浆。因此,良好的载体应具有以下功能:能够避免体内清除,增加细胞摄取能力和胞内释放药物且逃逸内涵体等功能,即“三位一体”梯次响应纳米药物载体。本文构建细胞外-膜-内“三位一体”梯次响应纳米药物载体,共载化疗药物和PI3K抑制剂,以乳腺癌肺转移为研究对象,以期获得“三位一体”的抗肿瘤转移治疗效果。构建的三种纳米载体如下:针对增加肿瘤细胞蓄积,我们采用酰化反应将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)连接,用乳化溶剂挥发法,将Akt的抑制剂槲皮素(quercetin,Qu)和化疗药物多西紫杉醇(docetaxel,DTX)共载于透明质酸(hyaluronic acid,HA)修饰的PLGA-PEI纳米粒(PP-HA/NPs)。PP-HA/NPs的粒径为209.8±10.8 nm,Zeta电位+(12.0±1.07)mV。细胞创伤愈合实验结果显示PP-HA/NPs能显著抑制4T1细胞横向迁移能力。细胞转移和侵袭实验结果显示PP-HA/NPs能显著抑制4T1细胞的纵向迁移能力,其对转移和侵袭的抑制率分别为95.6%和99.3%。其抗转移能力可能与下调p-Akt和MMP-9蛋白表达相关。HA的表面修饰能显著增加PP-HA/NPs在肿瘤细胞中的蓄积,因此增加了其细胞毒性、抑制细胞克隆形成和诱导细胞凋亡的能力。小动物荧光成像实验结果表明,PP-HA/NPs能够增加在肺组织和肿瘤的蓄积和滞留量,该结果提示PP-HA/NPs具有治疗乳腺癌生长以及乳腺癌肺转移的应用前景。为了改进PP-HA/NPs纳米递药系统表面带正电荷的不足,我们构建“三位一体”纳米载药体系:(i)采用电荷翻转技术,用2,3-二甲基马来酸酐(2,3-dimethylmaleic anhydride,DA)翻转PEI所带的电荷,预期达到血循环中避免被快速清除,(ii)利用电荷翻转增加与细胞的相互作用,增加细胞摄取,(iii)接枝溶酶体酶响应的短肽,使其在内涵体中加快药物释放;接枝PEI后载体材料具有质子缓冲能力,有助于纳米载体从内涵体逃逸出来。构建过程如下:采用溶酶体酶响应的短肽GFLGF(peptide)为linker,将PLGA和PEI连接,并用DA与PEI反应,构成了PLGA-peptide-PEI-DA新型载体材料。将DTX和PI3K抑制剂GDC0941(GDC)共载于该材料,构成PLGA-peptide-PEI-DA/NPs(PPP-DA/NPs)。PPP-DA/NPs的粒径为135.6±2.8 nm,Zeta电位为-(27.1±0.8)m V。体外实验表明PPP-DA/NPs的Zeta电位随着p H的降低发生翻转,在组织蛋白酶(cathepsin B,Cath B)条件下,药物释放加快,且PPP-DA/NPs具有一定的质子缓冲能力,该能力有助于其内涵体的逃逸。细胞实验结果证明PPP-DA/NPs能显著抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,电荷翻转能显著增加细胞摄取。细胞创伤愈合、迁移和侵袭实验结果表明,PPP-DA/NPs具有显著抑制4T1细胞迁移的能力,其抑制率分别为53.4%、96.1%和97.4%。Western blot实验结果显示,PPP-DA/NPs能下调p-Akt、MMP-9、caspase-9、caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平。在构建的荷瘤鼠原位荷4T1肿瘤转移模型上,与生理盐水组相比,PPP-DA/NPs的抑瘤率为68.4%,肺转移抑制率达到了95.3%。体内外实验结果证明PPP-DA/NPs实现了细胞外-膜-内三个位点梯次响应,并具有良好的抑制乳腺癌生长和乳腺癌肺转移效果。在“三位一体”纳米载药体系PPP-DA/NPs中,其载体量较低。为了提高载药量,我们选择负载效率高的氧化石墨烯(graphene oxide,GO)为基础载体,并结合“三位一体”纳米载体的设计理念,构建载体:用PEI接枝GO,修饰靶向小分子叶酸(folate acid,FA)和低分子的肝素(Heparin),利用其与细胞膜上FA受体、RAGE受体的结合,增加细胞摄取;同时,Heparin还具有翻转载体材料中PEI的电荷,使纳米颗粒带负电,避免在体内被快速清除。构建的GO载药系统如下:采用GO作为载体,依次与PEI-FA、Heparin反应,构建载体GO-PEI-FA/Heparin(GPFH)。将化疗药物多柔比星(doxorubicin,DOX)负载于GPFH,即DOX@GPFH,其DOX@GPFH粒径为232.8±9.0 nm,Zeta为-(42.8±1.6)m V,载药效率和负载率分别为89.4%和125.1%。然后将其与GDC以1:5(m/m)比例物理混合,即(DOX@GPFH)+GDC。结果表明:(DOX@GPFH)+GDC能增加细胞摄取,诱导细胞凋亡,且能下调p-Akt、MMP-9蛋白表达水平。细胞创伤愈合、迁移和侵袭结果表明,PPP-DA/NPs的抑制率分别为61.2%、81.0%和76.8%。在构建的荷瘤鼠原位荷4T1肿瘤转移模型上,与生理盐水组相比,(DOX@GPFH)+GDC的抑瘤率为77.0%,肺转移抑制率达到了73.7%。体内外实验结果证明(DOX@GPFH)+GDC负载率高、稳定性好、且具有良好的抑制乳腺癌生长和乳腺癌肺转移效果。以上研究结果表明,基于“三位一体”纳米载体的设计理念,联合化疗药物和PI3K/Akt信号通路抑制剂,有望实现安全有效的抑制乳腺癌的生长和转移,为开发抗乳腺癌转移的纳米递药系统提供了重要的依据。