细菌基因组DNA中存在具有免疫学刺激活性、以未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为核心的脱氧核苷酸序列,即CpG基序(CpG motif)。CpG ODN是指含有CpG基序的寡脱氧核苷酸。CpG ODN通过与胞内受体的TLR9结合,活化pDC细胞、B淋巴细胞、单核细胞等多种免疫细胞,可以作为一种潜在免疫增强剂,激活固有免疫应答,促进免疫细胞分泌产生IL-12、TNF-α、IFN-α/β和IFN-γ等细胞因子,促进Th1型适应性免疫反应。人工合成的含有5’-GACGTT-3’碱基序列的CpG ODN对小鼠免疫系统具有强烈的免疫刺激作用。pUC18-CpG质粒则是将含有10拷贝GACGTT的CpG基序克隆至pUC18载体中构建而成,由本实验室保存。将人工合成的CpG ODN和pUC18-CpG质粒分别刺激RAW264.7细胞,提取总RNA。以反转录的cDNA为模板,采用实时荧光定量PCR方法检测细胞因子和干扰素(IFN-β、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-12p40)的相对表达量。结果显示,在CpG ODN或pUC18-CpG刺激下,除IFN-γ外,IFN-β、IL-1β、TNF-α、IL-12p40的相对表达量分别达到了17.22±1.33、64.56±3.87、4.45±0.25、79.50±4.87和11.17±1.34、10.61±0.69、5.56±0.41、51.17±2.56,差异显著(P<0.05);除TNF-α外,CpG ODN刺激IFN-β、IL-12p40和IL-1β相对表达量较pUC18-CpG刺激表达量差异更显著(P<0.05)。重组pET-32a-3Eg95大肠杆菌经IPTG诱导表达,亲和层析纯化出重组蛋白3Eg95。重组蛋白分别与常规佐剂Quli-A、pUC18-CpG和CpG ODN配伍后,免疫小鼠。通过间接ELISA方法监测各组抗体效价平均水平,采用实时荧光定量PCR方法测定体外刺激实验后细胞因子的相对表达量。结果显示,pUC18-CpG组和CpG ODN组小鼠免疫后14天、28天以及42天ELISA抗体平均水平(OD450nm)分别为3.10±0.07、3.03±0.15、3.22±0.05和2.98±0.10、3.12±0.06、3.27±0.33,与Quli-A组抗体平均水平相比均差异均显著(P<0.05);CpG ODN组抗体平均水平略高于pUC18-CpG组,但差异不显著(P≥0.05)。体外制备小鼠脾脏淋巴细胞,经重组蛋白刺激后,pUC18-CpG组与CpG ODN组细胞IFN-β、IFN-γ和TNF-α的相对表达量分别为6.88±0.32、2.35±0.45、6.28±0.21和5.03±0.50、2.85±0.18、7.07±1.01,与Quli-A组相比差异均显著(P<0.05)。因此,在细胞免疫水平方面,pUC18-CpG和CpG ODN均能上调I型IFN和促炎性因子的表达,具有诱导Th1型免疫反应的特性;相对于常规佐剂Quli-A,pUC18-CpG和CpG ODN在体液免疫和细胞免疫方面对Eg95抗原都有显著的免疫增强作用,CpG ODN的免疫增强作用略优于pUC18-CpG,两者均可作为免疫佐剂,增强现有包虫病基因工程疫苗的免疫效果。