研究背景脑胶质瘤(Glioma)作为中枢神经系统中最为常见的颅内肿瘤,源于神经外胚层,其特点为高发病率、高死亡率、高侵袭性。虽然目前世界上针对胶质瘤的研究比较多,但对具体发病机制的分析仍未透彻。研究表明胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭与肿瘤细胞受体、相关基因及调控分子等密切相关。分子靶向治疗在临床治疗中有明显优势,具有靶向特异性、无细胞毒作用,对细胞作用稳定,有调节作用。目前的研究认为,在分子生物学机制上,肿瘤的形成与原癌或抑癌基因的异常表达以及细胞周期、凋亡的异常调控相关。因此探究调控胶质瘤细胞生物学行为的相关基因有助于进一步阐明胶质瘤的发病机制,为胶质瘤的基因靶向治疗提供清晰合理的理论依据。NKAP(NF-κB activating protein)是 TNF-α 和 IL-1 诱导的 NF-κB 的活化调控因子,位于细胞核内,在进化过程中高度保守。研究发现,在小鼠的OB、丘脑和海马的成熟神经元中NKAP高表达,这表明NKAP在神经发育中发挥着重要的作用。在T细胞分化过程中,NKAP通过分别和HDAC3、CIR相结合,成为Notch转录抑制复合物的一部分,作为Notch信号通路的转录抑制因子而发挥作用。在自然杀伤T细胞(iNKT)发育中,NKAP与HDAC3相互作用而不是作为Notch通路的转录抑制因子。此外,NKAP还调节iNKT的增殖和分化。我们发现,NKAP在胶质瘤中的表达增多,但其在肿瘤中的作用及其机制尚未有报道。Notch信号通路通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用,经剪切三次Notch 蛋白,释放胞内段(intracellular Notch receptor domain,NICD)入胞质,进而NICD转位进入细跑核,并与核内转录因子RBP-Jk结合,形成NICD\RBP-Jk转录复合体,调控下游靶基因的转录,从而产生生物学效应。研究表明,Notch信号通路在进化上高度保守,与细胞增殖、分化、命运决定等方面有很大的联系,异常表达时,易导致脑肿瘤的发生。在细胞的致瘤性转化过程中,Notch信号通路的激活可促进细胞增殖,并且在分子层面,通过维持细胞大小、促进细胞的能量摄取和新陈代谢、激活PI3K/AKt和NF-κB通路以及抑制肿瘤抑癌基因p53而起到抗细胞凋亡作用。我们通过体外培养胶质瘤细胞,利用CCK-8、EdU、FACS、Transwell、Matrigel、qRT-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、细胞转染等实验技术,体外检测NKAP对脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探索NKAP发挥作用的机制。此外,我们也利用裸鼠皮下成瘤和裸鼠原位种植肿瘤,在体实验验证NKAP对胶质瘤的作用。以期NKAP成为脑胶质瘤诊断和治疗新位点。研究方法1.明确NKAP在胶质瘤组织和细胞中的表达情况收集正常脑组织和不同WHO分级的胶质瘤病理组织,采用qRT-PCR技术、免疫组织化学的方法,检测NKAP的表达情况,并分析表达量与胶质瘤病理分级及患者预后的关系。2.探索NKAP对胶质瘤细胞的生物学作用的影响慢病毒NKAP-shRNA载体或阴性对照载体转染U87MG和U251,建立稳转细胞系,将细胞分为NKAP敲除组(NKAP ko)和对照组(NKAP Con)。(1)检测NKAP对胶质瘤细胞增殖能力的影响上述建立的稳转细胞系分别利用CCK-8、EdU、FACS技术检测细胞增殖能力的强弱。(2)检测NKAP对胶质瘤细胞侵袭、迁移和EMT能力的影响上述建立的稳转细胞系,分别利用Transwell迁移实验、Matrigel侵袭实验和测定EMT标志物表达量,检测NKAP对细胞的侵袭、迁移和EMT能力的影响。3.探究NKAP对胶质瘤的作用机制(1)qRT-PCR技术分别检测细胞U87MG和U251的NKAP ko组和NKAP Con 组中,Notch 信号通路下游基因 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、CCND1、HES1、CTNNB1和DVL2基因在mRNA水平的表达,进一步通过Western Blot实验方法进一步检测细胞中 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、CCND1、HES1、CTNNB1和DVL2在蛋白水平的表达情况。(2)收集正常脑组织和不同WHO分级的胶质瘤组织,制备组织芯片,进行NKAP和Notch1的免疫组织化学染色,分别观察NKAP和Notch1组织中的表达变化,分析二者的表达关系。(3)利用荧光素酶报告基因和ChIP实验探究NKAP对Notch1的调控作用。(4)拯救实验:质粒转染U87MG以过表达NKAP,加入DAPT阻断Notch信号通路,探讨其阻断后对过表达NKAP的U87MG生物学作用的影响。4.裸鼠体内实验验证NKAP通过调控Notch1促进胶质瘤细胞的增殖收集U87MG NKAP ko组和NKAP Con组的细胞,分别进行裸鼠皮下种植,每组细胞对应5只裸鼠,观察肿瘤的生长情况,待皮下都有种植肿瘤长出时,定期测量肿瘤体积变化,最后取出肿瘤,称取瘤重,并制作石蜡切片,进行免疫荧光化学染色。另外进行裸鼠颅内种植U87MG NKAP ko组和NKAP Con组的细胞,统计裸鼠的生存情况,并取脑制作切片,进行HE染色。研究结果1.临床组织的免疫组织化学染色(IHC)和qRT-PCR结果显示,NKAP定位于胶质瘤细胞的细胞核中;NKAP在正常脑组织几乎没有表达,而胶质瘤中表达增多,且随着恶性程度的增加,分化程度的减弱,NKAP的表达逐渐增多。2.(1)与对照组相比,NKAP敲除组在24h,48h,72h的OD(490)值明显减少,说明NKAP促进胶质瘤细胞的增殖;EdU实验结果也显示,NKAP敲除组胶质瘤细胞阳性细胞数明显减少;流式细胞(FACS)周期检测实验明确的显示NKAP敲除组处于G0/S期细胞数目显著减少。(2)Transwell迁移实验显示,NKAP敲除组穿过小室的细胞数目明显减少,Matrigel实验结果说明NKAP还促进胶质瘤细胞的侵袭:NKAP敲除后穿过基质胶进入小室膜底部的细胞明显减少。qRT-PCR结果显示,敲除NKAP后,EMT标志物N-cadherin、Twist1和Vimentin表达都减少。3.(1)敲除NKAP的胶质瘤细胞,其Notch信号通路的Notch1的表达量在mRNA水平和在蛋白水平都明显降低,其他基因没有明显表达变化。(2)免疫组织化学染色显示,NKAP和Notch1在正常脑组织中基本不表达,随着胶质瘤恶性程度增加,二者的表达均逐渐增加。统计学分析显示,NKAP和Notch1的在组织中的表达呈正相关关系。(3)荧光素酶报告基因显示,U87MG敲除NKAP后,Notch1转录活性减弱。ChIP实验发现,U87MG中Notch1的启动子位置检测到NKAP显著聚集。(4)拯救实验结果显示,阻断Notch信号通路可以抑制NKAP对胶质瘤细胞的生物学作用。4.在体实验进一步证实NKAP通过调控Notch1促进胶质瘤细胞的增殖,从而促进了皮下肿瘤的生长速度。由肿瘤生长曲线可以看出:NKAP的表达减少,肿瘤的生长速度减慢。免疫荧光实验结果显示,NKAP表达降低的肿瘤内,Notch1的表达也减少。生存分析显示,颅内种植敲除NKAP的U87MG后,裸鼠生存时间更长。结论1.NKAP在胶质瘤显著高表达2.NKAP促进脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。3.NKAP靶向Notch1,形成NKAP-Notch1信号轴,促进胶质瘤的发展。