来自马克思克鲁维酵母的尿酸氧化酶在大肠杆菌中的异源表达与无标签纯化

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尿酸氧化酶(UOX)在人体的嘌呤代谢中起到了重要的作用,是嘌呤代谢中一种关键的酶,它可以催化人体中尿酸转化为尿囊素和过氧化氢,尿酸在人体类的溶解度为11mg/100mLH2O,而尿囊素的溶解度约为147mg/100mLH2O,是尿酸溶解度的13.5倍左右,因此将尿酸转化为尿囊素可以促使尿囊素快速的溶解排除体内,从而降低人体内尿酸的含量。人类及灵长类动物在进化中失去了尿酸氧化酶的基因的活性,所以尿酸氧化酶一旦在人体中积累会引起例如痛风,高尿酸症,尿酸盐肾病等的各种病症。所以尿酸氧化酶是一种重要的医学用酶。
  尿酸氧化酶作为临床上一种新的治疗痛风的药物,可以迅速催化尿酸的分解从而降低人体内尿酸的含量,且可以降级人体内尿酸晶体的含量,相比于其他治疗方法尿酸氧化酶效果快且无副作用。血清中的尿酸含量是诊断痛风以及高尿酸症的重要标志,尿酸氧化酶同时还能用于人体中尿酸含量的检测,能够迅速的检测出人体内尿酸的浓度,尿酸氧化酶不仅能用于临床治疗,也能用于临床的检测试剂应用。
  我们的研究利用PCR技术从马克思克鲁维酵母中克隆尿酸氧化酶基因,构建了重组载体CBM3-INTEIN-UOX,重组质粒转化到了表达宿主菌株EscherichiacoliBL21(DE3)细胞中并通过IPTG诱导菌株,成功表达蛋白。重组菌株利用了纤维素结合模块与内含肽的结合,通过温度与ph值的改变从而断裂内含肽得到纯净的无标签尿酸氧化酶(KmUOX)。本研究对不同条件下内含肽的断裂情况,及蛋白的纯化效率进行了探索。通过纯化条件的摸索,最终发现在40℃9小时条件下的纯化效率可以达到得到77.11%。得到的纯净的尿酸氧化酶通过293mm紫外吸光值的变化测定,最终测出其最高酶活可以达到50.54IU/mg是之前有报道研究的尿酸氧化酶中活性最高的。其Km,Vmax,Kcat分别为67.60μM,56.35μmol/min·mg,和32.74S-1。在后续的性质摸索中发现其最适ph最适温度分别为9.0与42℃。在探索纯化后的尿酸氧化酶的热稳定性时候发现其能在40℃孵育90小时后仍能保持79.75%的活性,其具有一定的热稳定性。我们的研究发现了一种新的尿酸氧化酶,其与其他尿酸氧化酶比较有较高的酶活与一定的热稳定性,这为之后研究或应用尿酸氧化酶提供了一个新的选择。
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