【摘 要】
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表达载体pCAMBIA1300/GPAT的起始载体是pCAMBIA1300,质粒大小为8.96Kb,含有卡那抗性基因和潮霉素抗性基因.构建好的表达载体pCAMBIA1300/GPAT上有来自质粒QS115上的诱导性启
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表达载体pCAMBIA1300/GPAT的起始载体是pCAMBIA1300,质粒大小为8.96Kb,含有卡那抗性基因和潮霉素抗性基因.构建好的表达载体pCAMBIA1300/GPAT上有来自质粒QS115上的诱导性启动子(ABRC1+-60 Amy64 minimal promoter),它可在ABA诱导下表达、合成具有生物活性的非融合蛋白,避免转基因后在非寒冷条件下的不必要表达,有一定的实用价值.另一构建好的表达载体pBI121/GPAT质粒的起始载体是植物双元表达载体pBI121,质粒大小为13Kb,含有卡那抗性基因NPT-Ⅱ和GUS报告基因,将GUS报告基因切去,其位置由目的基因GPAT基因片段所取代. 该实验将构建好的这两个质粒转化到农杆菌中建立起农杆菌双元载体转化系统.对水稻和非洲菊的转化体系进行了初步摸索.研究了水稻品种滇优梗3号和滇优梗5号愈伤组织的形成与2,4-D,6-BA,蔗糖的关系;滇优梗3号和滇优梗5号对抗生素潮霉素的本底实验等.对于这两个品种而言,诱导愈伤的激素是3mg/L的2,4-D和0.2mg/L的6-BA搭配比较好,蔗糖浓度是20-30g/L,而用潮霉素的最佳筛选浓度是50mg/L.经过一系列的诱导、转化、筛选得到157个潮霉素抗性愈伤组织,其中滇优梗3号有60个,滇优梗5号有97个.对非洲菊R2品种进行了潮霉素和卡那霉素的本底实验;研究了2,4-D的浓度与叶柄、叶片上所形成的愈伤组织的关系;叶片和愈伤再分化与6-BA浓度关系;菌液的浓度、侵染的时间与叶片、愈伤转化效率关系.对于非洲菊R2而言,潮霉素用10mg/L的浓度,卡那霉素用30-50 mg/L的浓度筛选比较有效;用叶柄诱导愈伤组织比较好,诱导愈伤使用的2,4-D浓度为2.5-5 mg/L;在诱导未转化过的叶片和愈伤再分化中,6-BA 2-3mg/L有利于从叶片再分化为苗,1mg/L有利于从愈伤再分化为苗;在侵染中,将培养菌液用1:1的LB培养基和YEP培养基重悬菌液后稀释50倍侵染比较好,而且对叶片最合适的侵染时间是3-5分钟,愈伤是2-3分钟.通过带叶柄的叶片侵染方法,得到了转pCAMBIA1300/GPAT质粒的1个株系(PCR初步鉴定为阳性)和7株转pBI121/GPAT质粒的分化苗(PCR初步鉴定为假阳性),还有一些转化过的愈伤组织在分化阶段中. 该实验结果表明用非洲菊带叶柄的叶片进行转化是可行的.
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