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弧菌(Vibrio)是自然物种多样化的细菌,主要栖息于水体和水生动物中。分离到的弧菌中有70%以上是霍乱弧菌、副溶血孤菌和创伤弧菌,这些弧菌不仅对动物有致病性,还对人类健康有很大的威胁。被霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌感染的主要原因是吃了被污染的海产品和伤口暴露于水环境。其中副溶血弧菌是引起食源性细菌胃肠炎的最主要原因,主要的毒力因子是耐热直接溶血素(TDH)和耐热相关溶血素(TRH)。根据霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌groEL基因序列设计三对引物分别为groVc、groVp和groVv,建立同时检测三种弧菌多重PCR方法,经过对反应体系的优化,获得最佳反应体系为(25μL):PCR Mix 10μL,上下游引物(10pmM)各0.5μL,模板2gL,用ddH2O调整终体积至25μL。反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s；退火温度66℃,退火时间30s；72℃延伸30s,共30个循环,最后72℃延伸5min。检测结果表明该检测方法具有较高的特异性,对目标菌株DNA的检测灵敏度分别为霍乱弧菌1ng/μL,副溶血弧菌1ng/μL,创伤弧菌1ng/μL。该方法能同时检测到三种弧菌,为开展霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌感染的调查提供了技术手段。以副溶血弧菌的toxR基因、耐热直接溶血素(TDH)基因和耐热相关溶血素(TRH)基因为靶基因设计三对引物,建立检测副溶血弧菌主要毒力因子的多重PCR检测方法。经过对反应体系的优化,获得最佳反应体系为(25μL):PCR Mix 10μL,上下游引物(10pmM)量为trh各2μL,tdh各0.5μL; toxR各0.5μL,模板2μL,用ddH2O调整终体积至25μL。反应条件为94℃预变性4min；94℃变性,45s；退火温度60℃,退火时间45s；72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min。toxR、trh、tdh三对引物检测到的副溶血弧菌的最低浓度分别是1×10-2ng/μL, 0.1ng/μL,0.1ng/μL。特异性的检测及人工布菌试验,结果表明设计的引物具有较强的特异性。本方法可以作为一种快速检测致病性副溶血弧菌的方法。本试验以直接耐热溶血素(TDH)为抗原建立了检测副溶血弧菌的Dot-ELISA方法,血清抗体由本实验室研制,通过多次优化,确定最佳反应条件为加样的PVDF膜在20%的脱脂乳中封闭lh,与1：100的血清抗体反应30min,与1：1000的HRP-羊抗兔IgG反应1h,血清稀释液和洗涤液均为PBST。通过特异性及灵敏度的检测,表明该方法操作简单、快速、直观且不需特殊仪器,为基层及现场的检测提供了良好的技术手段。