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目的:研究中药苦参碱(Matrine Mat)对人口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞在体外增殖及诱导细胞凋亡的作用,并检测苦参碱对肿瘤凋亡的蛋白质中FAS、FASL、Caspase-3的影响,并探讨其可能的作用机制,并为苦参碱抗口腔鳞状细胞癌提供实验依据。方法:拟将人口腔鳞状细胞Tca8113细胞株设置为本实验的研究对象,用体外培养的方法将细胞分为阳性对照组(加入3ug/ml紫杉醇)、阴性对照组(加入不含有紫杉醇与苦参碱的配置培养液),实验组(加入不同浓度0.2、0.4、0.8、1.2mg/ml的苦参碱),分别培养24h、48h及72h后,分别采用以下几种方法进行观察和分析:1、采用倒置显微镜的方式分别观察各组的细胞形态学变化;2、利用MTT法检测Tca8113细胞的增殖活性,计算各组的细胞增殖抑制率;3、通过常规HE染色观察细胞核、细胞膜的变化,区分细胞坏死与凋亡;4、运用AO/EB染色法观察细胞凋亡的形态学变化;5、通过Hoechst33258染色法观察细胞的凋亡;6、采用透射电镜观察不同浓度作用于细胞后的超微结构变化;7、采取流式细胞仪检测苦参碱作用48h后细胞周期的分布情况;8、运用免疫荧光免疫细胞化学染色法检测各浓度苦参碱组对Tca8113细胞的凋亡蛋白半胱氨酸Capase-3蛋白的表达影响;9、采用免疫细胞化学染色(SABC三步法)检测苦参碱对细胞凋亡蛋白FAS、FASL、Caspase-3蛋白的影响。结果:1、对照组细胞在各时间段生长良好,成梭状贴壁生长,细胞透亮饱满,边界清楚。经作用不同时间后,细胞形态变圆并呈上浮状,细胞皱缩,折光性变强,出现空泡样变化;2、苦参碱作用于人口腔鳞状细胞癌Tca8113后能够抑制细胞的增殖,在同一时间段细胞的抑制率与细胞的浓度呈正相关;而在同一浓度苦参碱作用下,细胞的抑制率与作用时间呈依赖关系;3、苦参碱作用24h后,HE染色显示随苦参碱浓度的提高,细胞的贴壁率逐渐减少,细胞呈边集现象,在细胞膜边缘形成新月体形,甚至出现了凋亡小体的细胞凋亡特征;4、AO/EB染色后显示,阴性对照组细胞呈绿色荧光,细胞贴壁良好,细胞大小均一,并可见橘红色的RNA染色;实验组随着浓度的提高,细胞呈现的荧光由绿色逐渐向橙黄色与橘红色过渡,细胞核出现核固缩、核碎裂,并出现凋亡小体;5、苦参碱作用于细胞48h后,Hoechst33258染色显示对照组细胞呈现类圆形均匀蓝色荧光,边界清楚,色泽均一,实验组细胞核染色质呈固缩状,透亮,色泽不均匀;6、苦参碱作用于人口腔鳞状细胞癌Tca811348h后电镜观察显示,对照组细胞为典型的口腔鳞状细胞癌细胞形态,具有丰富且完整的细胞器,并有微绒毛附着于细胞表面,细胞核形态不规则,核膜完整,胞浆呈均匀分布,实验组细胞核染色质出现轻微的聚集,微绒毛减少或者消失,胞浆内出现线粒体空泡样早期细胞凋亡的改变,高浓度组细胞细胞内染色质固缩成团,聚集在核膜周边形成环状小体的典型细胞凋亡的特征;7、苦参碱作用于Tca8113细胞48h后,经流式细胞仪检测后,发现细胞增殖主要分布在G0/G1期,S期细胞与G2/M期比例逐渐减少;8、荧光免疫化学染色结果显示,随着苦参碱浓度的增加,细胞内出现的绿色荧光亮点逐渐增多,呈剂量依赖关系;9、采用免疫细胞化学SABC三步法染色,在显微镜下可以看到随着浓度的提高,FAS、Caspase-3蛋白表达逐渐增加,呈剂量依赖关系;FASL蛋白在苦参碱剂量增加后,表达量无明显改变。结论:1、苦参碱对人口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞具明显的体外增殖抑制作用且呈时间和浓度的依赖性;2、苦参碱能诱导人口腔鳞状细胞癌Tca8113凋亡,呈时间和浓度的依赖性;3、苦参碱可使Tca8113细胞细胞周期被阻滞在G0/G1期;4、苦参碱可上调Tca8113细胞中肿瘤凋亡蛋白FAS与Caspase-3蛋白的表达,从而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用;5、苦参碱可能无法通过降低FASL蛋白的表达,减少肿瘤细胞逃逸而抑制肿瘤的增殖;6、苦参碱可诱导人口腔鳞状细胞癌Tca8113凋亡,抑制体外增殖抑制作用,上调FAS蛋白、Caspase-3表达,激活细胞内核酸内切酶,诱导肿瘤细胞凋亡。