论文部分内容阅读
钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)是唯一活性依赖Ca2+/钙调素调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,它在神经系统、免疫系统以及心血管系统的生理病理过程中,参与一些重要基因的表达与调控,在生命活动中起着十分重要的功能。本实验室在前期工作中从体外蛋白质之间的相互作用水平、细胞水平以及动物模型水平对CN的性质和功能进行了一系列研究。
相对于体内丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族的其它酶来说,CN的底物选择性更加严格,范围相对较窄。因此,进行CN生理底物的鉴定,对认识CN在体内信号转导、细胞活动以及相关疾病的发生机理有着极其重要的应用价值。本文的目的是寻找CN新的生理底物,以期为进一步研究CN在信号转导通路中的功能提供新的切入点。
本文首先应用酵母双杂交技术筛选与CN相互作用的蛋白质。在酵母双杂交实验中,分别以CNA和BA蛋白为诱饵,在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y构建的cDNA文库中进行筛选,得到CN新的结合蛋白PSMA6。为进一步确证CN与PSMA6之间的特异性相互作用,接着进行了体外结合实验(GST pull-down)和体内结合实验(CO-IP),获得了与酵母双杂交相一致的实验结果,且发现了与PSMA6发生相互作用的是CN的催化亚基CNA。紧接着,我们构建了PSMA6 N端和C端剪切突变体,GST pull-down和CO-IP实验揭示PSMA6的N端结构域是PSMA6和CNA发生相互作用的结合区域;通过构建PSMA6点突变体,GST pull-down实验确定了PSMA6N端结构域上第63和64位的丝氨酸为这种相互作用所必需。随后,在SH-SY5Y细胞中过表达PSMA6的点突变体,CO-IP实验发现在细胞内可以与CNA发生相互作用的是游离态的PSMA6,而不是蛋白酶体中的PSMA6。
PSMA6是一种相对保守的蛋白质,为探究CNA与PSMA6之间的相互作用是一种普遍情况还是只在特定的细胞株(如神经细胞)中发生的特异性事件,将PSMA6转入小鼠单核巨噬细胞系的RAW264.7细胞中,随后的CO-IP实验结果提示CNA与PSMA6之间的相互作用可能普遍存在于细胞中。
本文所发现的CN和PSMA6相互作用复合体可能是一个至今尚未被认识的CN调控因素,进一步研究有望发现一个涉及CN调控的全新机制。