脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,是ICU常见病症。脓毒症的病理生理过程十分复杂,尽管当前抗感染及器官功能支持治疗取得了显著疗效,但脓毒症的病死率仍高达30%～50%。据统计,全球每年约有530万人死于脓毒症。脓毒症患者主要有两个死亡的高峰期,一是全身炎症阶段,二是免疫抑制期。当前的治疗水平下,绝大部分脓毒症患者能够度过严重的全身炎症反应阶段进入免疫抑制期阶段,处于免疫抑制期的患者常因无法控制的继发性感染和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)而死亡。研究显示,死亡的脓毒症患者中分布于淋巴结、脾脏、胸腺、小肠及其他器官中的淋巴细胞均发生广泛凋亡。脾脏作为人体最大的外周免疫器官,不仅是免疫细胞居住和对外源性抗原产生免疫应答的主要场所,其中的巨噬细胞还具有清除作用,使得脾脏在脓毒症免疫抑制中发挥着重要作用,胸腺和淋巴结分别作为T细胞产生和免疫应答的重要器官,在免疫抑制中同样发挥着重要作用。肝脏作为人体最大的腺体,在代谢和免疫稳态中起着重要作用,也是脓毒症最常见的损伤器官之一,在脓毒症的发展和发生过程中也起着关键作用。研究发现,免疫细胞的大量凋亡及炎症因子失衡所导致的免疫抑制现已成为脓毒症患者死亡的重要原因,病死率高达 40%～80%。近年来大量研究表明,脓毒症时胞外组蛋白作为最新发现的一种损伤模式(damage associated molecular pattern,DAMP)分子,主要由中性粒细胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)及凋亡或坏死的细胞释放,一旦释放到细胞外,可通过多种信号通路产生细胞毒性,引起内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、固有免疫细胞等凋亡并释放大量细胞因子进而诱导免疫应答紊乱造成器官损伤甚至机体死亡。临床研究发现,在严重脓毒症和脓毒性休克患者外周血清中组蛋白-DNA混合物的含量均显著性增高。因此,胞外组蛋白现已成为脓毒症治疗的潜在靶点。肝素属于糖胺聚糖,其主要双糖单位为三硫酸双(IdoA2S03-GlcNS036S03),具有很强的电负性。2014年Wildhagen等人通过表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)证实肝素能直接结合组蛋白,并有效减轻组蛋白的细胞毒性作用达到对脓毒症小鼠的治疗作用。众所周知,肝素具有很强的抗凝作用,此外,其还具有抗炎、免疫调节特性、糖萼保护等多种作用。但是,肝素潜在的出血风险使其在脓毒症的应用中受到很大限制。通过对肝素进行多种方式衍生化,筛选可以有效替代肝素,且与胞外组蛋白具有较强的亲和作用同时可降低抗凝活性的肝素衍生物已成为研究发展的方向。本课题组在前期研究中发现,经高碘酸氧化、硼氢化钠还原制备的肝素糖醛酸C2-C3断裂肝素衍生物(HP-SP),对肝素的主链结构并未破坏,同时保留了肝素的高硫酸化程度。本课题组还发现,虽然HP-SP的体外抗凝活性大幅降低,但其仍能够显著改善脓毒症小鼠高凝状态;HP-SP可通过抑制乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶-9的表达保护脓毒症小鼠的脑、小肠和心脏的糖萼;HP-SP还具有抗肿瘤转移活性。肝素衍生化的方式主要包括降解为低分子片段、脱硫酸基、破坏其抗凝戊糖结构等。本课题选择不同大小的肝素片段dp6、dp12及dp24,硫酸化低的硫酸乙酰肝素以及HP-SP为研究对象,从分子、细胞和动物水平优选出HP-SP这个胞外组蛋白拮抗剂。随后考察了其对胞外组蛋白致淋巴细胞凋亡和巨噬细胞吞噬活性减弱的保护作用;采用双打击方法复制了脓毒症免疫抑制小鼠,考察HP-SP对该模型小鼠淋巴细胞(CD4、CD8)的保护和炎症因子(IL-6、TNF-α IL-1β和IL-10)的调节作用,对免疫相关器官(脾脏、胸腺、淋巴结、肝脏、小肠)和肾脏的保护作用,以及对脓毒症免疫抑制小鼠生存率的改善作用。本研究取得的结果以及结论主要有:1.在分子和细胞水平上对不同分子量、硫酸化程度、糖醛酸开环的肝素衍生物与组蛋白亲和作用规律的研究1.1分子水平考察不同肝素衍生物与组蛋白的相互作用研究利用SPR技术考察了不同分子量、硫酸化的肝素衍生物和HP-SP与组蛋白亲和力的大小及规律。结果显示,不同分子量肝素衍生物与组蛋白亲和力的大小排序为:肝素钠≈依诺肝素钠≈dp24≈dp12>dp6;肝素糖醛酸开环的衍生物与组蛋白亲和力的大小排序为:肝素≈HP-SP≈达肝素>M402;不同硫酸化肝素衍生物与组蛋白亲和力的大小排序为:肝素>硫酸乙酰肝素。1.2在细胞水平上考察不同肝素衍生物对组蛋白致内皮细胞凋亡的保护作用的研究采用流式细胞术测定了胞外组蛋白对EA.hy 926内皮细胞凋亡保护作用的研究。结果发现,100μg/mL肝素等样品干预对100μg/mL组蛋白所致EA.hy 926细胞凋亡的影响中,各组内皮细胞(空白对照组、组蛋白组、肝素组、dp6组、dp12组、dp24组、依诺肝素组、达肝素、M402组、HP-SP组、硫酸乙酰肝素组)存活率分别为:(92.53土0.47)%、(31.83±2.48)%、(90.26±1.80)%、(49.77土0.47)%、(76.03±1.08)%、(81.50士0.79)%、(84.7±1.87)%、(87.87±1.02)%、(84.4±1.93)%、(89.13±1.87)%、(85.77±0.76)%。不同分子量肝素衍生物对内皮细胞保护强弱为:dp6<dp12<dp24<肝素;糖醛酸开环肝素衍生物对内皮细胞保护的存活率为:HP-SP>M402;不同硫酸化肝素衍生物对内皮细胞保护的存活率为:肝素>硫酸乙酰肝素。上述分子和细胞水平研究表明,肝素及其衍生物与组蛋白拮抗能力的大小与其分子量(亲和力实验,分子量小于1800 Da时分子量越小结合能力越弱;内皮细胞实验,分子量越小,拮抗组蛋白细胞毒性的能力越弱)、硫酸化程度(硫酸化程度越低,结合能力越弱)有一定的关系,糖醛酸开环对其无明显影响,从分子水平和细胞水平筛选HP-SP作为拮抗组蛋白最优的肝素衍生物。2.HP-SP的体外抗凝活性测定及其对组蛋白所致小鼠生存率的影响采用羊血浆抗凝法测定了 HP-SP的抗凝效价为17.08 IU/mg。通过小鼠尾静脉注射100 mg/kg组蛋白,并提前2 min尾静脉注射30 mg/kg肝素钠和HP-SP溶液进行干预后,考察了小鼠24h生存率。其中,组蛋白组小鼠24 h的生存率为0%,给予HP-SP和肝素治疗后二者均能快速拮抗组蛋白发挥对机体的保护作用,给药组24h存活率均为100%。上述结果表明,肝素糖醛酸开环反应制备所得的HP-SP,能在体内迅速拮抗组蛋白达到对机体的保护作用,同时抗凝活性大幅降低。3.HP-SP拮抗胞外组蛋白对淋巴细胞和巨噬细胞的保护作用3.1 HP-SP对淋巴细胞的保护作用研究采用流式细胞术测定了 HP-SP和肝素对组蛋白(50 μg/mL)作用1h时致淋巴细胞凋亡的保护作用。结果显示,空白组淋巴细胞的存活率为(87.20±2.22)%,组蛋白组(29.89±2.57)%,肝素组(84.77±1.64)%,HP-SP 组(84.91±2.55)%。该结果表明,组蛋白对淋巴细胞具有很强的细胞毒性,HP-SP和肝素能够通过拮抗组蛋白发挥对淋巴细胞的保护作用(P<0.05)。3.2 HP-SP对巨噬细胞吞噬能力的保护作用研究通过中性红实验考察了组蛋白在不同浓度、作用不同时间时对巨噬细胞吞噬作用的影响。结果显示,组蛋白对巨噬细胞吞噬能力的影响具有一定的时间(6h、12h、24h)和浓度(25、50、100、200、300、400、50μg/mL)依赖性,当组蛋白浓度为300 μg/mL,作用于巨噬细胞分别6h和12 h时均呈现出抑制吞噬的趋势(P>0.05,与空白组相比);选择组蛋白浓度300μg/mL作用时间12 h为最佳条件,开展HP-SP对巨噬细胞保护作用的研究。进一步考察不同浓度(50、100、200、400μg/mL)HP-SP及肝素对巨噬细胞吞噬能力的保护作用。结果显示,低剂量(50 μg/mL)的HP-SP和肝素便可通过拮抗组蛋白达到对巨噬细胞的保护作用,当浓度为100μg/mL时,HP-SP和肝素对巨噬细胞吞噬能力的保护达到最大(P≤0.001,与组蛋白组相比)。上述HP-SP对免疫细胞保护作用研究表明,胞外组蛋白对淋巴细胞和巨噬细胞具有很强的细胞毒性,小剂量的HP-SP和肝素便可通过迅速拮抗胞外组蛋白,减弱淋巴细胞的凋亡和并保护巨噬细胞的吞噬能力。4.HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠炎症因子的调节及对CD4、CD8淋巴细胞和免疫器官保护作用的研究采用CLP法造模72 h后,腹腔注射5 mg/kg LPS诱导脓毒症免疫抑制小鼠模型,并CLP在手术4 h后连续3天,HP-SP和肝素组分别尾静脉注射HP-SP(8 mg/kg)和肝素(3 mg/kg)干预治疗,假手术组和CLP组均尾静脉注射同等剂量生理盐水。4.1 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠血浆中IL-6、IL-10及胞外组蛋白水平的影响CLP造模96 h后,采用ELISA法测定小鼠血浆中IL-6、IL-10及胞外组蛋白水平,结果显示,CLP组(脓毒症早期)IL-6含量显著增加(P<0.05,与假手术组比),IL-10和胞外组蛋白水平均无明显增加;CLP-LPS组(免疫抑制期)IL-6含量明显降低,IL-10和胞外组蛋白水平均显著增加(P<0.05,与CLP组比)。当提前给予HP-SP和肝素进行干预治疗时,二者均可通过显著降低IL-10和胞外组蛋白水平,但对IL-6水平无显著性改变(P>0.05,P<0.05,与CLP-LPS组比)。上述结果表明,第二次打击后,处于脓毒症免疫抑制期(CLP-LPS组)的小鼠促炎因子IL-6的释放受到明显抑制(P<0.05),抗炎因子IL-10释放显著增加(P<0.05),这符合免疫抑制期机体炎症水平失衡的特征,同时胞外组蛋白水平在免疫抑制期显著升高。当提前给予肝素和HP-SP干预时,二者可通过降低胞外组蛋白水平保护免疫细胞的凋亡来抑制IL-10的释放,但对促炎因子IL-6水平无明显影响。对于所检测的这三个指标,非抗凝的HP-SP与肝素的作用均无显著差异(P>0.05)。4.2脓毒症免疫抑制小鼠脾脏、胸腺、淋巴结组蛋白H4、CD4及CD8的免疫组化测定CLP造模96h后,采用免疫组化法检测了小鼠脾脏、淋巴结及胸腺中H4、CD4和CD8蛋白表达情况。结果显示,CLP-LPS组小鼠脾脏、淋巴结及胸腺中CD4和CD8淋巴细胞均显著减少(P<0.05,与假手术阻比),其中,CD8淋巴细胞减少程度弱于CD4淋巴细胞,且三种免疫器官中组蛋白H4表达均显著增加(P<0.05),进一步考察CD4/CD8的比例发现,CLP-LPS组小鼠中脾脏、淋巴结及胸腺CD4/CD8的比例显著降低(P<0.05)。当提前给予肝素和HP-SP进行干预治疗时,二者均能够通过拮抗胞外组蛋白H4的细胞毒性有效缓解免疫器官中CD4和CD8淋巴细胞的凋亡情况(P<0.05);其中HP-SP可有效提高脾脏和淋巴结CD4/CD8的比例(P<0.05),但对胸腺CD4/CD8比例虽有提高但无显著性差异;肝素可有效提高淋巴结CD4/CD8的比例(P<0.05),对脾脏和胸腺CD4/CD8比例虽有改善但无显著性差异。上述结果表明,免疫抑制期(CLP-LPS组)小鼠脾脏、胸腺和淋巴结都发生CD4和CD8淋巴细胞大量凋亡且CD4/CD8的比例显著下降,这与三脏器中胞外组蛋白的细胞毒性密切相关。当提前给予肝素和HP-SP进行干预治疗时,二者均能够通过拮抗胞外组蛋白H4的细胞毒性有效缓解免疫器官中CD4和CD8淋巴细胞的凋亡情况(P<0.05),且对淋巴结的改善效果要强于脾脏和胸腺组织,HE的研究观察也支持该结果。4.3 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠脾脏、胸腺、淋巴结病理改变的影响CLP造模96 h后,采用HE染色对脾脏、胸腺和淋巴结病理变化进行了评估。结果显示,CLP-LPS组淋巴结、胸腺和脾脏中淋巴细胞均减少且排列疏松,其中脾脏中存在大量中性粒细胞且巨噬细胞增生现象。当提前给予肝素和HP-SP干预时,二者均能明显改善三者病理改变情况且对于淋巴结的改善效果强于脾脏和胸腺。上述结果表明,处于免疫抑制期小鼠免疫器官(脾脏、胸腺及淋巴结)淋巴细胞数目减少且排列疏松,免疫组化结果已验证三个脏器存在较高水平组蛋白单体(H4),因此,三者淋巴细胞的减少与胞外组蛋白的毒性相关。当提前给予肝素和HP-SP时,二者均可通过拮抗胞外组蛋白,抑制免疫器官淋巴细胞凋亡,改善组织病理损伤,这与HP-SP和肝素拮抗胞外组蛋白,保护免疫细胞,抑制IL-10的大量释放进而改善组织免疫抑制有关。上述HP-SP对脾脏、胸腺、淋巴结保护作用研究表明,提前给予HP-SP和肝素能够在体内通过拮抗胞外组蛋白细胞毒性,可抑制免疫抑制期小鼠抗炎因子IL-10的大量释放调节炎症水平,并且可保护脾脏、淋巴结及胸腺中CD4、CD8淋巴细胞免于其大量凋亡对免疫抑制的免疫紊乱进行调节,进而改善脓毒症免疫抑制达到对机体的保护作用。5.HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠肝损伤保护作用的研究采用CLP法造模72 h后,腹腔注射5 mg/kg LPS诱导脓毒症复制免疫抑制小鼠模型,并在CLP造模4h后连续3天,尾静脉注射分别注射8 mg/kg HP-SP和3 mg/kg肝素钠溶液进行干预。5.1 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠肝组织中胞外组蛋白、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10及胞外组蛋白水平的影响CLP造模24h和96h后,采用ELISA法测定小鼠肝组织中胞外组蛋白、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10。结果显示,24h和96h时,CLP-LPS组IL-6、TNF-α IL-1β、IL-10和胞外组蛋白含量均显著性增加(P<0.05),且96h时,胞外组蛋白和IL-6的水平明显低于24h,但IL-10水平则明显升高。当提前给予肝素和HP-SP进行提前干预时,二者均可显著降低肝组织中胞外组蛋白、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10的水平(P<0.05)。上述结果表明,在脓毒症初期(24h)由于胞外组蛋白的毒性,肝组织处于促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)主导阶段,而到脓毒症免疫抑制期(96h)处于抗炎因子(IL-10)主导阶段;当给予肝素和HP-SP干预治疗时,肝素和HP-SP可以通过降低肝组织中胞外组蛋白的水平,进而降低IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10炎症因子水平,达到对肝组织的保护作用。肝脏的HE检测和肝功酶学支持这一结果。5.2 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠肝功能指标AST、ALT的影响CLP造模12h、24h和96h后,采用微孔法测定小鼠血清中AST、ALT水平变化。结果显示,CLP-LPS组小鼠在12h、24h和9h时,AST和ALT水平均显著性升高(P<0.05),且在术后24h内持续增加。当提前给予肝素和HP-SP进行干预治疗时,二者均可通过拮抗胞外组蛋白调节炎症水平减少肝损伤,降低AST和ALT的水平支持该结果。上述结果表明,脓毒症时,小鼠肝损伤在脓毒症早期便发生,这与肝组织中胞外组蛋白可致炎症因子大量释放致使肝细胞凋亡、坏死有关。当提前给予肝素和HP-SP治疗时,二者均可通过拮抗胞外组蛋白降低TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平,减弱肝组织的损伤程度,从而降低血清中AST和ALT的水平。5.3 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠相对肝脏重量及肝组织病理损伤的影响CLP造模24h和96h后,结果显示,在24h时,各组相对肝重并无明显差异(P>0.05),在96h时相对肝重有所增加,但无显著性差异(P>0.05,与假手术组相比)。HE染色结果显示,96h时,处于免疫抑制期的小鼠多数肝细胞出现中度肿胀,肝窦变窄,并出现灶状炎性坏死病灶。当提前给予肝素和HP-SP干预治疗时,可有效改善肝脏病理损伤。上述肝损伤的研究表明,HP-SP和肝素可以通过降低肝组织中胞外组蛋白水平进而减少肝组织中IL-6、TNF-α IL-1β和IL-10炎症因子的释放,进而改善免疫抑制状态减少肝损伤。AST、ALT水平的降低和HE染色结果均支持该结论。6 HP-SP对脓毒症免疫抑制小鼠小肠和肾脏的保护作用以及对脓毒症免疫抑制小鼠7天生存率的影响6.1小鼠一般情况观察及7天体重变化CLP造模连续7天观察发现,脓毒症小鼠在CLP术后出现多种病态表现,即精神萎靡,尾部有稀水样粪便连,眼周存在分泌物有的内眦有出血症状,体重下降,且解剖后腹部恶臭等。结果表明,脓毒症小鼠造模成功。观察小鼠7天体重变化发现,CLP-LPS组小鼠7天内体重显著降低,肝素和HP-SP干预治疗可明显改善小鼠体重的下降。6.2小鼠小肠和肾脏HE染色及7天生存率考察CLP造模96h后,小鼠小肠和肾脏HE染色发现,CLP-LPS组小肠绒毛萎缩并且上皮细胞发生明显脱落,肾脏被膜增厚。当提前给予肝素和HP-SP的干预治疗时,可以有效改善小肠和肝脏的病理变化状态。7天生存率观察发现,CLP-LPS组小生存率为14.2%,当提前给予肝素和HP-SP的干预治疗时,二者均能显著的提高脓毒症小鼠的生存率,其中肝素组生存率为42.8%,HP-SP组生存率为35.7%。上述表型研究表明,提前给予HP-SP和肝素能够在体内通过拮抗胞外组蛋白细胞毒性调节炎症水平和保护免疫细胞进而改善免疫抑制状态,达到对脓毒症小鼠小肠粘膜损伤和肾脏的损伤的保护作用,同时可有效改善脓毒症小鼠的体重降低并显著提高脓毒症小鼠7天的生存率。7结论本课题研究发现,低抗凝的HP-SP在体内外均具有拮抗胞外组蛋白细胞毒性的作用,籍此发挥对脓毒症免疫抑制小鼠的免疫相关器官和免疫细胞等的多方面保护作用,改善免疫抑制状态,或藉此作用阻止脓毒症由SIRS期进入更为棘手和凶险的CARS期,这对于脓毒症的治疗有重要价值。8本课题的创新性及潜在的应用价值(1)肝素衍生物可以与组蛋白相互作用,但是,其作用规律并未进行系统研究。本课题在分子和细胞水平探索了肝素及其衍生物和组蛋白相互作用与分子量大小、硫酸化程度及糖醛酸开环之间的规律。结果发现,肝素及其衍生物与组蛋白的亲和作用会随着肝素分子量和硫酸化程度的降低而减弱,而肝素非硫酸化糖醛开环对其无明显影响。(2)肝素的潜在出血危险使其在临床应用中受到很大限制。本课题发现,HP-SP具有较小的抗凝活性,且保留了肝素较强的硫酸化程度,与肝素有着几乎相同的亲和组蛋白的能力。(3)胞外组蛋白作为DAMP分子,对于其研究大多数集中在脓毒症早期研究。本课题研究发现,在脓毒症免疫抑制期,胞外组蛋白仍有着较高水平,这为免疫抑制期的干预研究提供了新的研究方向。10本课题今后的研究方向HP-SP拮抗组蛋白对免疫细胞保护的分子机制,以及HP-SP拮抗胞外组蛋白发挥肝脏和小肠保护作用后,对脓毒症时紊乱的免疫水平的调节作用和机制需要进一步研究。