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肿瘤坏死因子受体-Fc抗体融合蛋白TNFR-Fc在治疗风湿性、类风湿性关节炎方面具有很好的疗效,但是由于对TNFR-Fc日益增长的需求与其价格昂贵、哺乳动物细胞表达抗体融合蛋白能力低的矛盾限制了其在治疗和诊断方面的使用。因此,针对表达TNFR-Fc抗体融合蛋白的CHO-GS细胞,设计一种成本较低的无血清培养基,并且建立经济高效的流加培养工艺,对于TNFR-Fc抗体融合蛋白成功迈向产业化很重要。1、CHO-GS细胞无血清培养基的优化：(1)氨基酸浓度的优化。通过对CHO-GS细胞在商业化的EX-CELLTM302培养基中的氨基酸代谢分析,优化基础无血清培养基(SFM)中的氨基酸浓度,结果如下：Asp,20mg/1; Thr,180mg/l; Ser,25mg/l; Glu,40mg/l; Cys,30mg/l;Val,50mg/l; Met,50mg/l; Ile,50mg/l; Leu,60mg/l; Tyr,40mg/l; Phe,60mg/l; Lys,60mg/l; His,30mg/l;Trp,30mg/l; Pro,70mg/l;(2) Plackett-Burman筛选主要影响因素。依据Plackett-Burman实验设计,评估乙醇胺,亚硒酸钠,腐胺,氢化可的松,脂类,丙酮酸钠,谷胱甘肽,氯化胆碱,D-泛酸钙,叶酸,烟酰胺,盐酸吡咯醛,核黄素,盐酸硫胺,氯钴胺素和肌醇十七中因子对CHO-GS细胞生长和蛋白表达的影响。统计分析结果表明腐胺,乙醇胺,脂类,丙酮酸钠,氯化胆碱及泛酸钙对细胞生长有积极作用,同时腐胺(p<0.01)对蛋白表达也有重要的促进作用；而亚硒酸钠,抗坏血酸,谷胱甘肽,核黄素和肌醇对细胞生长有抑制影响；(3)中心组合试验设计确定重要因子的最优浓度。通过中心组合实验设计,确定了最大抗体生产量时脂类、腐胺和柠檬酸铁铵的浓度,分别为：0.5×,1.5mg/l和0.75mM；总之,通过实验设计获得的CHO-SFM,最大细胞密度为3.5x106/ml,较基础培养基提高了84%；TNFR-Fc终产量为85.59mg/1,较基础培养基提高了9.3倍。2、CHO-GS细胞在CHO-SFM与EX-CELLTM302培养基中摇瓶培养的生长代谢及抗体表达特性。结果表明：细胞在CHO-SFM与EX-CELLTM302中获得的最大细胞密度分别为3.73×106cells/ml和3.64x106cells/ml,两者没有很大差别；CHO-SFM中的细胞比生产率(7.97mg/109cell/day)较EX-CELLTM302(6.70mg/109cell/day)提高了19%；CHO-SFM的终抗体产量(90.95mg/l)较EX-CELLTM302(76.95mg/l)提高了18%；两者的唾液酸含量分别为61.8μg/mg和62.1μg/mg,均符合TNFR-Fc合格的标准。3、CHO-GS细胞在CHO-SFM培养基中的适应性及稳定性分析。细胞在CHO-SFM中能够很快地适应,连续传代25天,细胞依然能够很好地增殖并且保持较高的活力,比生长速率μ基本维持在0.22-0.28h-14、生物反应器中CHO-GS细胞流加工艺的建立。结果表明：流加培养中,最大活细胞密度达到了4.32×106/ml,较批次培养提高了20%；而比生产速率由7.64mg/109cell/day提高到10.28mg/109cell/day,较批次培养增加了41%；TNFR-Fc产量由122mg/l增加到378mg/l,较批次培养提高了2.1倍。