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原癌基因erbB2（HER-2或neu)，其编码产物是分子量为185kDa的一种酪氨酸激酶，又称为p185蛋白。该蛋白由1255个氨基酸残基组成，属EGFR蛋白家族成员。乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多种恶性肿瘤组织中，p185erbB2蛋白过表达比例较高。p185erbB2蛋白的过表达能够增加肿瘤细胞侵袭、转移的能力。因此，p185erbB2蛋白是一个进行肿瘤生物治疗理想的抗原分子靶点。进口药物抗p185erbB2蛋白的曲妥珠单抗(Herceptin(R))对晚期乳腺癌的治疗具有显著疗效，但价格昂贵。为探讨应用乳腺生物反应器生产抗p185erbB2蛋白抗体可行性，本研究构建了抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异表性达载体，制备了抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的转基因小鼠乳腺生物反应器模型，为将来利用转基因大动物乳腺生物反应器生产抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26及开发抗p185erbB2抗体药物进行了积极探索。 抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体的构建 目的:构建抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体。方法:利用PCR法扩增出抗人p185erbB人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L，然后分别将嵌合抗体重链基因H和嵌合抗体轻链基因L连接到乳腺特异性表达质粒pBC1，从而构建抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。结果:经测序验证，抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的嵌合重链基因H和嵌合轻链L基因分别与乳腺特异表达质粒pBC1正确正向连接。结论:成功构建抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L，为今后制备抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺生物反应器模型的研究奠定了基础。 第一部分 抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型的制备 目的:制备抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型。方法:分别将抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异表达载体pBC1-H和pBC1-L线性化，然后使用原核显微共注射法获得8只转基因FVB小鼠，通过鼠尾直接PCR鉴定它们是否为转基因阳性。通过RT-PCR、荧光定量PCR鉴定转基因小鼠乳腺组织中抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达。使用小鼠乳汁采集器收集其乳汁并通过Western blot和夹心ELISA等实验鉴定抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26是否获得表达。结果:鼠尾直接PCR结果显示所获8只转基因FVB小鼠均为转基因双阳性小鼠，且抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的重链H基因和轻链L基因在它们的后代中稳定遗传，它们的后代中转基因小鼠双阳性率约30％; RT-PCR和荧光定量PCR的结果显示转基因双阳性小鼠及其双阳性后代的乳腺组织中存在抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达;Western blot和ELISA等实验结果显示转基因双阳性小鼠乳汁中存在抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的蛋白表达，而且抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26与羊抗人K链抗体和羊抗人IgG Fc-HRP抗体均能特异性结合。结论:成功制备了抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型，为今后抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因大动物乳腺生物反应器的研究奠定了理论和技术基础。 第二部分 抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26相关生物学特性的研究 目的:鉴定抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的相关生物学特性。方法:通过ELISA和Western blot等实验测定或鉴定抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的浓度、抗原特异性和人源性。通过CCK-8检测、HE染色细胞学形态观察、透视电镜超微结构观察、细胞凋亡流式细胞仪检测和细胞周期流式细胞仪检测等实验鉴定抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26诱导SKOV3细胞凋亡的功能特性。结果:夹心ELISA实验结果显示转基因双阳性小鼠乳汁中抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的平均浓度为0.24mg·L-1;直接ELISA实验显示抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26能特异性结合人erbB2胞外抗原蛋白;夹心ELISA实验、直接ELISA实验和Western blot实验结果表明抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26具有人源性;CCK-8检测结果表明0.48mg·L-1抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26作用SKOV3细胞24小时后，其对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制率平均值为53.63％，略低于0.5mg·L-1Herceptin作用24小后SKOV3细胞增殖的抑制率平均值58.43％(P＜0.05);HE染色和透视电镜观察结果显示抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26具有诱导SKOV3细胞凋亡的功能;细胞凋亡试剂盒流式细胞仪检测结果显示0.48mg·L-1抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26作用卵巢癌SKOV3细胞24小时后，其诱导SKOV3细胞凋亡的中晚期凋亡率平均值为27.3％，低于0.5mg·L-1Herceptin作用SKOV3细胞24小时后诱导凋亡的中晚期凋亡率平均值35.75％(F=898.71，P＜0.01);细胞周期试剂盒流式细胞仪检测结果显示抗p185erbB2人鼠嵌合抗体作用24小时后对SKOV3细胞周期产生一定的阻遏作用。结论:抗p185erbB2人鼠嵌合抗体对SKOV3细胞具有抗原特异性并具有诱导其凋亡的功能特性，为卵巢癌的生物治疗提供了新的策略。