JAK(Janus kinase)属于非受体酪氨酸激酶家族。在哺乳动物中,JAK-STAT信号通路被证实涉及造血作用、胚胎发育、组织稳态、先天性免疫和适应性免疫等多个生物学过程。本研究中,我们主要利用RNAi技术抑制拟穴青蟹JAK基因的表达,进而探究JAK基因在拟穴青蟹先天性免疫功能中发挥的作用。利用实时荧光定量PCR检测拟穴青蟹各组织中JAK基因的表达量,结果显示JAK在肠道中的表达量最高,在血细胞和心脏中的表达量较低。通过RNAi技术,成功达到敲低JAK基因表达的目的。在JAK基因被敲低后,检测拟穴青蟹典型的先天性免疫分子及信号转导因子的表达量。结果显示,拟穴青蟹多个重要的免疫基因的表达量均显著下调,其中造血激素Astakine的表达量下降尤为显著。在敲低JAK基因表达后,酚氧化酶(phenoloxidase,PO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和溶菌酶(lysozyme,LZM)的活性显著降低,而细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量则显著上升。以上结果表明JAK基因能影响部分免疫信号通路基因表达和酶的活性。拟穴青蟹在感染溶藻弧菌后,JAK基因的表达量在72小时内显著上调。生存分析结果显示JAK基因被敲低后,感染溶藻弧菌的青蟹的死亡率显著上升。血细胞吞噬试验结果显示,在JAK基因被敲低后,青蟹血细胞吞噬溶藻弧菌的能力显著上调,同时血细胞凋亡率也显著上调。以上这些结果表明拟穴青蟹JAK基因可能通过调控细胞吞噬和细胞凋亡作用,参与拟穴青蟹对溶藻弧菌的免疫反应。拟穴青蟹在感染WSSV后,JAK基因的表达量在48小时内显著上调,随着时间的推移表达量逐渐下降,但在72小时的表达量仍显著高于0小时。经JAK-ds RNA处理敲低JAK基因后,拟穴青蟹血细胞吞噬WSSV的能力显著提高,血细胞凋亡率也显著上调,而血细胞总数则显著下降。生存分析和WSSV拷贝数显示,JAK基因被敲低后拟穴青蟹的死亡率和病毒拷贝数均显著上调。以上结果表明干扰JAK基因的表达可能会削弱拟穴青蟹对WSSV感染的免疫力,说明JAK基因参与拟穴青蟹对WSSV感染的免疫反应。在Astakine的免疫功能验证试验中,首先对JAK基因进行干扰后,造血激素Astakine的表达量在72小时内显著下降。在Astakine-ds RNA处理后,检测Astakine在拟穴青蟹血细胞增殖方面的功能,发现青蟹血细胞总数和增殖能力显著下降,而血细胞凋亡率则显著上升。以上结果说明Astakine基因参与拟穴青蟹血细胞增殖功能和细胞凋亡。JAK-ds RNA处理后,对拟穴青蟹血细胞增殖等相关指标进行检测,得到与Astakine-ds RNA处理相同的结果。以上结果表明JAK基因对拟穴青蟹血细胞的增殖也起正向调控作用,结合JAK基因对造血激素Astakine基因表达量的影响,JAK基因应该是通过调控造血激素Astakine进而影响血细胞增殖功能。综上所述,本研究揭示了JAK基因在拟穴青蟹先天性免疫中的作用机制,证明了JAK基因参与拟穴青蟹对病原体(WSSV或溶藻弧菌)的免疫反应并发挥重要作用,另外发现JAK可以通过调控造血激素Astakine表达影响血细胞增殖功能,为进一步探究拟穴青蟹先天性免疫功能提供理论依据。