包虫病,是由棘球蚴寄生于人体及多种动物体内所致的一种严重的人兽共患寄生虫疾病。该病严重危害人类健康和畜牧业发展,目前已成为全球性的公共卫生问题。在我国以细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, E. granulosus)感染引起的囊性包虫病为主,至今仍未得到有效控制。对虫体免疫逃避机制以及生理适应性认识不足制约了细粒棘球蚴疫苗及药物的设计与开发。细粒棘球绦虫的幼虫阶段即原头节,不仅能够在终末宿主的小肠中发育成成虫,而且可以在中间宿主体内发育成单室性包囊(即“双向发育”能力)。此外,它能够感染、适应多种哺乳动物宿主。这些特点让原头节成为寄生虫-宿主相互作用研究的重要模型。本课题从宿主-病原相互作用关系入手,探索细粒棘球绦虫原头节感染对小鼠免疫系统的作用,尤其关注免疫细胞前体细胞——髓源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)在感染前后差异表达基因对其功能的调控；同时利用转录组测序以及生物信息学技术,分析原头节排泄分泌蛋白整体功能特征。研究结果将深化细粒棘球绦虫免疫逃避机制及其生理适应性认识,为进一步开展包虫病新型疫苗的设计及优化、药物靶标的筛选提供重要分子基础。第一部分细粒棘球绦虫原头节感染小鼠免疫细胞表型及功能宿主免疫系统的功能、状态是宿主抵抗寄生虫的关键,而免疫逃避是寄生虫在宿主体内生存的必要条件。前人研究表明E. granulosus原头节感染可显著下调或抑制宿主免疫应答,是其免疫逃避的重要因素,但究竟是怎样的调节机制至今尚不明确。本研究从整体水平研究E. granulosus原头节感染对宿主执行固有和适应性免疫应答细胞功能的影响,探索其可能的免疫逃避机制。从病羊肝脏(或肺脏)包囊中收集原头节,分子鉴定为G1型,腹腔注射感染Balb/c小鼠,2000条/只,建立细粒棘球蚴病小鼠模型。同时设立生理盐水对照组。在感染后不同时间点(30,180,360 d)采集小鼠外周血和脾脏,制备单细胞悬液。通过多色流式细胞术检测小鼠脾脏和外周血中各种免疫细胞的表型特点及比例,并结合功能实验,探索原头节感染对宿主免疫系统的影响。结果,在感染后30天,表达CD11b、CD11c分子的细胞(即抗原递呈细胞)比例增加,但其MHC-Ⅱ分子表达轻微下调。在整个实验过程中,感染组小鼠固有免疫细胞如抗原递呈细胞、GR-1+粒细胞比例均明显增加,值得注意的是,共表达CD11b+/Gr-1+标志的髓源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)比例显著升高。随着感染进程深入,CD4+和CD8+T细胞表面激活标志CD69, CD44, CD40L的表达上调,幼稚T细胞标志CD62L的表达下调；而CD4+/CD25+/Foxp3+T细胞(Treg)比例持续上升。感染组脾脏T细胞增殖能力显著低于正常组水平(P<0.05)。结果表明,原头节感染Balb/c小鼠免疫系统环境发生了微妙改变,这种变化在慢性感染阶段表现尤为明显。伴随着感染,T细胞被逐渐激活,但同时一些免疫抑制细胞如Treg、MDSC的比例持续增加,影响宿主针对虫体抗原物质的T细胞免疫应答。本研究提示这些抑制性细胞在E. granulosus长期感染过程中可能发挥着极其重要的但尚被忽视的免疫下调作用。第二部分细粒棘球绦虫原头节感染小鼠M-MDSC源免疫调控分子的筛选髓源抑制性细胞(Meyloid-derived suppressor cells, MDSC)是一群异质性细胞,来源于骨髓祖细胞和未成熟细胞,是DC、Macrophag e、粒细胞的前体。大量研究表明,MDSC在肿瘤模型中发挥着强大的免疫抑制作用。在第一部分,我们发现细粒棘球绦虫原头节感染可诱导MDSC在Balb/c、鼠外周血和脾脏中显著富集,有助于E. granulosus抑制宿主抗虫体免疫应答,但具体作用机制研究仍不清楚。最新研究表明,单核型MDSC (monocytic-type MDSC, M-MDSD)是MDSC发挥免疫抑制作用的主要细胞群。本研究将以M-MDSC为模型,利用小鼠全基因表达谱筛选M-MDSC免疫调控相关分子,为E. granulosus免疫逃避机制提供新的见解。收集E. granulosus原头节不同感染阶段Balb/c小鼠脾脏以及对应正常组小鼠脾脏,制备单细胞悬液,利用磁珠分选技术分离M-MDSC,提取总RNA进行小鼠全基因组表达谱分析。利用生物信息学对感染前后M-MDSC差异基因进行注释及功能分析,并利用Real-time PCR验证基因差异表达情况。结果表明,感染前后M-MDSC存在1090个差异基因。Real-time PCR验证了27个差异基因,其中24个与芯片结果相符。蛋白网络分析表明感染M-MDSC趋化能力和转录能力均减弱,可能影响M-MDSC的正常分化。同时,获得了一批潜在功能分子,其差异表达可能影响DC、Mφ功能以及与T细胞相互作用,是MDSC发挥免疫调节作用的分子基础。第三部分细粒棘球绦虫原头节排泄分泌蛋白基因转录特征分析原头节是细粒棘球绦虫的幼虫阶段,具有“双向发育”的能力,能够感染、适应多种哺乳动物宿主,成为寄生虫-宿主相互作用研究的重要模型。众所周知,虫体排泄分泌蛋白(excretory-secretory proteins, ESPs)在寄生虫-宿主互作过程中发挥着关键作用,是寄生虫疫苗、诊断、药物的重要靶标。但由于ESPs成分复杂,蛋白表达丰度不一,以及宿主蛋白的干扰等原因,利用蛋白质组学不能完全解析ESPs组分。本研究利用454测序技术对绵羊流行株G1型细粒棘球绦虫原头节转录组进行了测序,结合生物信息学方法重点分析了潜在ESPs基因转录特征,为全面了解细粒棘球绦虫生理学适应性奠定基础。抽取细粒棘球绦虫原头节总RNA,逆转录制备cDN A。采用GS-FLX Titanium General Library Preparation Kit构建cDNA文库,利用Roche 454 GS-FLX Titanium平台进行测序。测序结果经除去低质量Reads及测序接头后拼接、组装成原头节转录本。生物信息学方法提取转录本中潜在ESPs,探索其在原头节生理适应过程中的作用。本研究共获得26514条Unigene,其中,22910条(86.4%)成功地比对到新近发布的细粒棘球绦虫基因组序列,17705条(66.8%)分布在序列编码区域。从原头节转录本中共预测到2280条ESPs,138、124条分别参与碳水化合物、蛋白质代谢。其中,11种ESPs作为胞内酶参与调节糖酵解／糖异生作用；高表达的ESPs转录本包括44种抗原性蛋白,25种分子伴侣以及4种蛋白酶。此外,一些ESPs参与发育相关的信号通路,如TGF-β受体通路,insulin信号通路等。本研究表明原头节分泌的ESPs不仅参与介导宿主免疫应答,而且参与碳水化合物代谢、抵抗敌对的宿主内环境以及参与发育相关的关键信号通路。研究结果将深化寄生虫生理适应性的认识,为包虫病诊断、疫苗、药物新靶标的筛选提供新的思路。结 论本课题从宿主-病原相互作用关系入手,探索细粒棘球绦虫原头节免疫逃避机制及生理适应性,取得了如下结果：1.运用多色流式细胞术揭示E. granulosus原头节感染后Balb/c小鼠脾脏和外周血中免疫细胞浸润和激活过程中的关键事件：(1) APCs表面MHCⅡ分子表达明显下调,可能影响寄生虫抗原递呈；(2)感染虽能持续激活T细胞,但免疫抑制性细胞群(如Treg, MDSC)富集可能抑制其免疫应答反应。2.采用Agilent小鼠芯片筛选E. granulosus原头节感染前后M-MDSC差异表达分子,发现原头节感染明显下调小鼠M-MDSC的趋化及转录相关分子表达,影响其正常分化及成熟；此外,一些差异表达分子可能影响其与T细胞相互作用,是M-MDSC发挥免疫调控的分子基础。3.利用Roche 454测序解析了E. granulosi ts原头节潜在排泄分泌蛋白(ESPs)基因转录特征：原头节分泌的ESPs不仅参与介导宿主免疫应答,而且参与碳水化合物代谢、抵抗敌对的宿主内环境以及参与发育相关的关键信号通路。研究结果深化了寄生虫生理适应性认识,为包虫病诊断、疫苗、药物新靶标的筛选提供新的思路。