【研究背景】慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是常见的呼吸系统疾病,其患病率高,危害范围广,严重威胁全球人类健康。慢阻肺危险因素众多,除烟草烟雾外,室内空气污染（特别是生物燃料来源烟雾）是其另一个重要的危险因素,越来越受到关注。慢阻肺发病机制复杂且病理表现多样,为一异质性疾病。生物燃料烟雾所致慢阻肺在临床表现和病理改变上与烟草烟雾所致慢阻肺有所区别,主要表现为小气道疾病,特别是在慢阻肺早期阶段。小气道纤维化为主的气道重塑是慢阻肺早期病理改变的主要特征,也是气流受限主要发生的部位。平滑肌细胞除作为结构细胞起收缩作用外,其增殖和分泌细胞外基质能力在气道重塑过程中起关键作用。细胞外基质的紊乱是小气道纤维化过程中重要一环,作为细胞外基质蛋白的一员,基质蛋白Tenascin-C（TNC）在慢阻肺患者小气道表达异常增加,但其具体如何参与慢阻肺的发生发展尚不清楚。生物燃料烟雾所致慢阻肺气道重塑中细胞外基质沉积报道甚少。TGF-β作为促纤维化因子,是否可以参与生物燃料烟雾导致慢阻肺气道重塑过程还有待进一步探讨。本课题从生物燃料烟雾致大鼠慢阻肺模型和体外生物燃料细颗粒物作用于培养人支气管平滑肌细胞两个水平上,探讨生物燃料对慢阻肺气道重塑,特别是细胞外基质沉积方面作用,另外进一步研究沉积基质蛋白TNC在慢阻肺发生发展中的作用,为理解生物燃料参与慢阻肺小气道重塑提供一定的理论基础。第一部分:TNC和TGF-β1在生物燃料烟雾致大鼠慢阻肺中表达增加目的生物燃料烟雾是慢阻肺危险因素之一,慢性气道炎症和小气道重塑是慢阻肺常见病理改变,细胞外基质沉积是小气道纤维化重要的环节。本部分主要探讨生物燃料烟雾慢性暴露对大鼠肺部形态学影响以及大鼠肺部和全身炎症反应和小气道细胞外基质沉积及TGF-β1表达的影响,并对大鼠肺部TGF-β1的表达与细胞外基质蛋白的表达进行相关性分析。方法24只雄性SD大鼠随机分为2组分别接受洁净空气和生物燃料烟雾暴露1个月和6个月,收集大鼠肺组织和血清。HE染色观察肺组织结构改变和气道重塑情况;多因子检测大鼠肺组织和血清细胞因子表达情况;免疫组化观察肺部TGF-β1表达和细胞外基质蛋白沉积;ELISA检测大鼠血清TNC蛋白表达和大鼠肺组织及血清TGF-β1蛋白表达。结果1.大鼠肺部形态学改变:生物燃料烟雾暴露6月后,大鼠肺泡平均间隔为（76.38±9.16μm）,小气道壁厚度为（18.45±1.43μm2/μm）,平滑肌层α-SMA蛋白表达为（2.38±0.15）,平滑肌层占气道厚度比值WA%为（11.77±1.18）%,相比洁净空气组大鼠平均肺泡间隔（50.95±1.31μm）明显增宽,小气道壁厚度（15.24±1.31μm2/μm）明显增厚,平滑肌层α-SMA蛋白表达（1.64±0.17）明显增加以及平滑肌层占气道厚度比值WA%（8.34±0.99）%明显增厚,差异有统计学意义（P值均小于0.05）。2.大鼠肺部炎症和血清炎症水平改变:生物燃料烟雾暴露1个月和6个月后,肺组织趋化因子MCP-1、MIP-1α、RANTES,炎症因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-17A以及IFN-γ相比洁净空气组明显增高;血清趋化因子G-CSF、MCP-1、MIP-1α、RANTES;炎症因子IL-1α、IL-2、IL-6、IL-13、IL-17A以及IFN-γ、VEGF相比洁净空气组明显增高。3.大鼠肺部和血清TGF-β1表达:a.血清ELISA结果显示:生物燃料烟雾暴露1个月和6个月大鼠血清TGF-β1表达分别为[（64.01±4.55 pg/m L）、（60.01±3.68 pg/m L）],相比洁净空气组[（49.53±2.67 pg/m L）、（49.42±2.07 pg/m L）]均增加,差异有统计学意义（P<0.05）。b.大鼠肺组织TGF-β1表达分别为[（29.83±2.13 pg/mg）、（31.11±2.13 pg/mg）],与洁净空气组[（23.75±1.99 pg/mg）、（21.16±2.69 pg/mg）]相比,暴露6个月后表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。c.大鼠肺组织免疫组化结果显示:在生物燃料烟雾暴露6个月后,大鼠小气道TGF-β1表达量为（13.21±0.84）,相比洁净空气组（10.19±0.75）表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。4.大鼠肺部细胞外基质蛋白改变:与6个月对照组相比,生物燃料烟雾暴露6月后大鼠小气道周围细胞外基质蛋白,包括糖蛋白TNC、FN、蛋白聚糖VCAN以及胶原I和胶原IV等沉积明显增多。（TNC:6.27±0.79 vs 3.26±0.55;VCAN:3.01±0.68 vs 3.24±0.54;FN:2.35±0.34 vs 0.93±0.25;Collagen I:9.18±1.16 vs4.12±0.61;Collagen IV:13.11±1.51 vs 8.55±1.02;P<0.05）,胶原III表达没有差异（10.23±1.49 vs 9.01±1.36;P>0.05）。5.大鼠肺部TGF-β1与细胞外基质蛋白相关性分析:TGF-β1表达与糖蛋白TNC、FN、蛋白聚糖VCAN以及胶原I、胶原IV显著相关,差异有统计学意义（P<0.05）,相关系数分别为（TNC:r=0.725,VCAN:r=0.711,FN:r=0.788,Collagen I:r=0.805,Collagen IV:r=0.830）;与胶原III相关性不明显,无统计性差异（P<0.05）小结:生物燃料烟雾慢性暴露6个月后可引起大鼠肺气肿和气道重塑,其中平滑肌细胞层增厚为主;同时伴随有慢性肺部炎症和全身系统性炎症发生,小气道周围TGF-β1表达增加及大量细胞外基质蛋白如TNC等沉积,且TGF-β1表达于基质蛋白表达增加显著相关。第二部分:生物燃料PM2.5对人支气管平滑肌细胞炎症的影响及机制目的慢性气道炎症是慢阻肺主要病理改变之一,支气管平滑肌细胞具有一定分泌炎症因子功能,本部分主要探讨生物燃料来源细颗粒物（BRPM2.5）对支气管平滑肌细胞分泌炎症中的作用及机制。方法不同浓度BRPM2.5不同时间点刺激HBSMC和16HBE细胞;分别以TGF-β中和抗体、TGF-β受体抑制剂、MAPK通路（ERK/P38）和AKt通路抑制剂等措施干预细胞,CCK8法检测BRPM2.5对HBSMC和16HBE细胞活力的影响;以实时荧光定量PCR和ELISA法分别检测IL6和IL8 m RNA和蛋白表达。结果1.不同浓度的BRPM2.5不同时间点作用于HBSMC可诱导IL6和IL8m RNA和蛋白表达增加:相比DMSO组,不同浓度的BRPM2.5（4μg/m L,8μg/m L）刺激HBSMC 72h后IL8 m RNA和蛋白表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。4μg/m L BRPM2.5刺激48h和72h相比同时间点DMSO组IL8表达明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;4μg/m L BRPM2.5刺激16HBE细胞48或72h后,IL6 m RNA和蛋白表达相比DMSO组明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;但8μg/m L BRPM2.5刺激后IL6表达未改变（P>0.05）。2.TGF-β中和抗体可抑制BRPM2.5诱导HBSMC IL8分泌:与BRPM2.5处理组相比:1μg/m L的TGF-β中和抗体预处理后BRPM2.5处理组IL6和IL8m RNA和蛋白表达均无差异（P>0.05）;10μg/m L的TGF-β中和抗体预处理后BRPM2.5处理组IL6 m RNA和蛋白表达无差异（P>0.05）,但IL8 m RNA和蛋白表达均降低,差异有统计学意义（P<0.05）。3.ALK5抑制剂和ERK1/2、P38、Akt通路抑制剂可抑制BRPM2.5诱导HBSMC IL6和IL8 m RNA和蛋白表达:相比BRPM2.5处理组,ALK5抑制剂和p38MAPK、Akt通路抑制剂预处理后BRPM2.5处理组,IL6 m RNA和蛋白表达显著下降,差异有统计学意义（P<0.05）;相比BRPM2.5处理组,ALK5抑制剂和ERK,p38MAPK通路抑制剂预处理后BRPM2.5处理组,IL8 m RNA和蛋白表达显著下降,差异有统计学意义（P<0.05）。4.BRPM2.5可促使16HBE细胞分泌TGF-β1表达增加,但不能促进HBSMC分泌TGF-β1表达增加:相比DMSO组,BRPM2.5处理组16HBE细胞TGF-β1蛋白表达显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）;相比DMSO组,BRPM2.5处理组HBSMC TGF-β1蛋白表达无改变（P>0.05）。5.PCR结果证实BRPM2.5可下调细胞外基质蛋白TNC m RNA表达,上调VCAN m RNA表达,对其他细胞外基质蛋白m RNA表达无影响:相比对照组而言:BRPM2.5处理组TNC m RNA表达下调,VCAN m RNA表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）;其他细胞外基质蛋白m RNA表达均无改变（P>0.05）。小结BRPM2.5可通过TGF-β/LAK5通路和非经典通路（ERK/P38/Akt）刺激支气管平滑肌细胞分泌IL6和IL8。BRPM2.5可促进上皮细胞释放TGF-β,但不能促使支气管平滑肌细胞释放TGF-β。第三部分:TNC参与TGF-β1诱导气道平滑肌细胞慢阻肺样病理改变目的平滑肌细胞增殖和分泌细胞外基质参与气道重塑过程,从而导致慢阻肺气流受限。本部分主要探讨TGF-β1对支气管平滑肌细胞（HBSMC）增殖和分泌细胞外基质蛋白及炎症因子的作用及机制,以及基质蛋白TNC在其中的作用及机制。方法1.TGF-β1刺激HBSMC,实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测细胞外基质蛋白TNC、FN、Collagen I和α-SMA m RNA和蛋白表达。2.TGF-β1刺激HBSMC,免疫荧光和流式细胞术检测平滑肌细胞增殖;ELISA法检测细胞上清中炎症因子IL6和IL8表达。3.TGF-β受体ALK5抑制剂,以及ERK/P38/Akt通路抑制剂预处理,TGF-β1刺激后,实时荧光定量和免疫蛋白印迹分别法检测细胞外基质蛋白TNC、FN、Collagen I和α-SMA m RNA和蛋白表达。4.运用si RNA技术沉默SMAD2/SMAD3和TNC表达后,TGF-β1作用HBSMC后,实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹分别检测TNC、FN、Collagen I和α-SMA m RNA和蛋白表达;免疫蛋白印迹检测TGF-β1转录因子SMAD2,SMAD3磷酸化水平;ELISA检测细胞上清中炎症因子IL6和IL8表达。结果1.TGF-β1可诱导HBSMC增殖、细胞外基质蛋白TNC、FN、Collagen I及α-SMA表达和炎症因子IL6,IL8的表达增加:相比TGF-β1未处理组,TGF-β1不同浓度不同时间点处理组HBSMC增殖增加,细胞外基质蛋白TNC、FN、Collagen I及α-SMA m RNA和蛋白表达明显增加,炎症因子IL6和IL8蛋白表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.SMAD2/3-si RNA可抑制TGF-β1诱导细胞外基质蛋白TNC、FN、Collagen I及α-SMA表达:相比NC-si RNA+TGF-β1组,SMAD2-si RNA+TGF-β1组和SMAD3-si RNA+TGF-β1组HBSMC细胞外基质蛋白TNC、FN、Collagen I及α-SMA m RNA和蛋白表达明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。3.ALK5抑制剂和ERK1/2、P38、Akt通路抑制剂可抑制TGF-β1诱导HBSMC细胞外基质蛋白TNC、FN、Collagen I和α-SMA表达:对于TNC而言,相比TGF-β1处理组,ALK5抑制剂和ERK1/2、P38、Akt通路抑制剂预处理后TGF-β1处理组TNC m RNA和蛋白表达均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）;对于FN、Collagen I和α-SMA言:ALK5抑制剂和P38、Akt通路抑制剂预处理后TGF-β1处理组TNC m RNA和蛋白表达均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）;4.TNC-si RNA可抑制TGF-β1诱导HBSMC增殖,细胞外基质蛋白FN表达和炎症因子IL6、IL8分泌:与NC-si RNA+TGF-β1组相比,TNC-si RNA+TGF-β1组HBSMC增殖,细胞外基质蛋白FN m RNA和蛋白表达以及炎症因子IL6、IL8表达均降低,且差异有统计学意义（P<0.05）。5.TNC-si RNA可减弱TGF-β转录因子SMAD2/3磷酸化:与NC-si RNA相比,TNC-si RNA可以抑制TGF-β1不同时间点（15min,30min,1h）诱导HBSMC细胞SMAD2/SMAD3分子的磷酸化水平,差异有统计学意义（P<0.05）。小结TGF-β1可通过其经典ALK5/SMAD依赖通路和非经典的SMAD3不依赖通路诱导HBSMC增殖,分化和分泌细胞外基质及炎症因子IL6和IL8。TNC可通过调控SMAD2/3磷酸化水平参与TGF-β1诱导HBSMC增殖,细胞外基质蛋白FN表达以及炎症因子IL6和IL8的分泌。【全文结论】1.生物燃料烟雾慢性暴露可引起大鼠肺气肿和气道重塑,伴随肺部炎症和全身系统系炎症反应,以及肺部细胞外基质蛋白异常沉积。2.TNC和TGF-β1在生物燃料烟雾暴露大鼠肺中高表达。3.TGF-β1可通过其经典和非经典通路诱导HBSMC增殖、分化和细胞外基质蛋白表达及炎症因子表达。4.TNC通过作用SMAD2/SMAD3磷酸化参与TGF-β1诱导HBSMC增殖,FN表达和炎症因子IL6、IL8分泌。5.BRPM2.5可间接通过TGF-β通路和MAPK、Akt通路促进HBSMC炎症因子IL6和IL8分泌。