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蝎子是古老的物种,其种类、进化史及其毒素的多态性,引起世界各国科学家极大的研究兴趣。蝎子尾腺分泌毒液,其毒液中含有多种生物活性成分,主要有由蛋白质和非蛋白质两组分组成。蝎毒的蛋白质成分主要是一类由20~80个氨基酸小分子多肽(通称为蝎毒素),每一种蝎子其毒液中约含有50~100种蝎毒素,存在较强的多态性变化。现已证实,蝎毒素作用的靶目标为兴奋和非兴奋细胞质膜上的离子通道,蝎毒素与通道结合后可以引起通道电流的阻断或门控动力学的改变。蝎毒素可分为:Na+通道、K+通道、Cl-通道和Ca2+通道(主要存在于骨骼肌细胞浆膜上)毒素。 分离新的蝎毒素基因,是采用分子生物学方法研究蝎毒素的前提与基础。构建cDNA文库对于分离目的基因,特别是多基因家族成员的蝎毒素基因具有特别重要的价值。以中国产东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch,BmK)毒腺组织为材料,成功地构建了一个高质量的cDNA文库。随机挑取14个克隆子,用PCR方法进行鉴定,结果表明,5个克隆子均含有插入片段,大小为300~600bp。 采用通用引物测序的方法,从已构建的蝎毒腺细胞cDNA文库中筛选得到一个新的537bp的cDNA序列,被命名为BmTxKS4(GenBank登记号为AY278247)。BmTxKS4的cDNA的5′和3′端非编码序列(UTR)分别长111bp和189bp;有两个加尾信号AATAAA在距poly(A)上游37bp和14bp处。此序列含有一个234bp的开放阅读框(ORF),编码78个氨基酸,其中包括21个氨基酸残基的信号肽、11个氨基酸残基的前肽,46个氨基酸残基的成熟肽,三对二硫键。根据cDNA推测所得的氨基酸序列分别与钾离子通道蝎毒素AGTX1、AGTX2、AGTX3、KTX1、Bs6、Pi3、Pi2、BmTx3、ChTx-a和BeKm-1分别有35.5%,35.5%,35.5%,35.5%,35.5%,35.5%,30.6%,27.8%,26.1%,25.0%,22.6%,的同源性。 提取蝎总DNA,根据BmTxKS4 cDNA的5′和3′端非编码序列(UTR)设计PCR引物,从蝎总DNA中克隆到BmTxKS4的全长基因。序列分析发现BmTxKS4含有