实验背景ICC是广泛分布于胃肠道平滑肌和神经丛的一类特殊类型间质细胞。研究证实其主要功能有[1,2]:1、胃肠道慢波活动的起搏细胞;2、促进电活动的传导;3、介导胃肠神经和平滑肌之间信号传导;4、作为牵张感受器协调机械压力的输入。许多胃肠动力障碍性疾病与ICC的异常变化有关。因此,在胃肠道把ICC作为治疗和研究的靶目标很有现实意义。但是体外分离和培养ICC仍存在许多不确定因素,尤其是长期培养ICC的可行性及ICC的生物学特性等问题仍然不能解释清楚。有关ICC的培养、传代、冻存及复苏也未见报道,因此摸索ICC长期培养的条件,了解细胞生物学特性,为持续性研究ICC功能打下基础。近来研究显示在ICC上已经发现了十余种类型的受体,包括:胆囊收缩素受体A[3]、G蛋白偶联受体(PKA,PKC)[4]、胆碱能(M2,M3)受体[5]、神经激肽(NK1 ,NK3)受体[6]、嘌呤能(P2Y1, P2Y4,P2X2, P2X5)受体[7,8]、五羟色胺(5-HT, 5-HT3, 5-HT4)受体[9,10]等。受体的研究对诠释细胞功能及新型药物研发有重要的指导意义。胃动素是由22个氨基酸组成的单链脑肠肽,主要由十二指肠和空肠黏膜上皮Mo内分泌细胞分泌。其生理作用是来调节胃肠移行性运动复合波(MMC)。而胃动素调节胃肠活动的机制一个重要突破口就是胃动素受体的分布及受体后信号通路的研究。根据目前报道胃动素受体在不同物种的胃肠平滑肌细胞和肠神经元均有表达[11,12,13,14,15,16,17,18]。而作为胃肠功能单位神经-ICC-平滑肌网络中ICC是否会存在胃动素受体表达?我们先前的关于ICC在胃动素受体激动剂诱导平滑肌收缩中作用机制的研究显示ICC可能存在胃动素受体表达[19]。实验目的本研究目的就是探讨ICC的培养、冻存与复苏、传代的条件,了解细胞的生物学特性;分别从细胞形态学、基因和蛋白水平来验证ICC上是否存在胃动素受体的表达。实验方法第一部分:以兔小肠为ICC组织来源,应用胶原酶消化法分离、培养ICC;特异的c-kit抗体对ICC进行免疫荧光鉴定;对细胞进行传代培养;摸索细胞冻存和复苏的条件;用MTT法测定传代后细胞生长曲线。第二部分:新鲜分离的细胞和培养15天的细胞分别进行流式细胞分析c-kit阳性细胞比率,选用阳性率高的方法进行ICC的分选;以流式细胞仪分选的ICC为靶细胞,分别采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)技术。将提取的细胞总RNA和总蛋白,进行分析检测;应用特异性c-kit蛋白抗体、胃动素受体抗体(anti-GPR38)以及细胞核染料(hoechst33342)对培养的细胞进行免疫荧光染色;从基因和蛋白水平以及细胞形态方面来验证ICC是否表达胃动素受体。实验结果1、普通光镜和免疫荧光分析证实成功分离、培养ICC;细胞传代达数次,且生长状态良好;对数生长期的ICC经冻存后复苏成功;成功绘制出细胞生长曲线。2、比较新鲜分离的细胞和培养数日的细胞流式分析结果,c-kit阳性细胞比率。前者为9.8%,后者为19.1%。培养的细胞经流式分析的阳性细胞比率高;选用培养的细胞进行流式分选作为细胞来源。再次流式分析培养的细胞中c-kit阳性细胞比率为64.3%,分选出阳性细胞分别为6.7×105个和5.6×106个;分别对提取ICC的总RNA和总蛋白分析检测显示胃动素受体mRNA以及受体蛋白定性分析结果均为阳性;细胞免疫荧光三标实验显示ICC胞膜上存在胃动素受体表达。结论ICC的成功培养、传代及冻存复苏,为细胞建系打下基础,也为相关领域的研究提供了科学可行的方法指导,不但节省了资源,也必将促进ICC研究的深入开展;基于以上实验结果,首次证实培养的兔肠道ICC上有胃动素受体表达,进一步提示ICC可能在胃动素促胃肠动力方面发挥重要的作用。