火炬松cpDNA全序列分析与遗传多样性检测

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本研究采用改进的高盐低pH法和CTAB法分离火炬松叶绿体及其DNA,获得完整的叶绿体和纯度较高的叶绿体DNA(chloroplastDNA,cpDNA);将此高纯度DNA通过Solexa高通量测序法原理进行测序,并对所得叶绿体DNA序列进行分析,整理,序列比对和基因功能注释等。利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,设计引物,从火炬松叶绿体基因组中扩增ycf1基因,检测8个亲本间的遗传多样性。主要研究结果如下:  (1)利用高盐低pH值法提取火炬松8个样品的cpDNA,所得cpDNA的平均浓度为846.7ng/ul,体积各200ul,OD260/280平均值为1.891,OD260/230平均值为1.787。  (2)通过Solexa高通量测序法原理对202样品的cpDNA进行测序,所得基因组长度为121,531bp,GC比例为38.5%。与公共数据库NCBI中发布的火炬松cpDNA序列(基因组长度为12,048bp。GC比例为37.9%,缺口gap数78个,长度为1615bp)相比,测序结果序列完整度更高。  (3)本研究测得火炬松cpDNA基因共121个,其中包括4个外显子和7个内含子。余下的110个基因按其功能可分为16类,按这些基因编码的产物的多少可分为:tRNA-氨基酸即转移核糖核酸(34个)、光体系蛋白(26个)、核糖体蛋白(21)、ATP合成酶相关亚基(7个)、细胞色素类(6个)、rRNA即核糖体核糖核酸(4个)、核糖核酸酶(4个)、假设的叶绿体蛋白(2个)、翻译起始因子1(1)、核酮糖,核酮糖二磷酸羧化酶(1个)、原叶绿素酸酯还原酶亚单位B(1)、成熟酶K(1)、膜蛋白(1)和乙酰辅酶A羧化酶β亚基(1)。  (4)从公共数据库NCBI中获得100条相似cpDNA序列,即与火炬松具有同源性的松树。其中有11种松树cpDNA的序列比对覆盖度为99%,49种松树cpDNA的序列比对覆盖度在90%-99%,28种松树cpDNA的序列比对覆盖度在80%-89%,11种松树cpDNA的序列比对覆盖度在60%-79%,还有1种松树cpDNA的序列比对覆盖度为32%。  (5)利用Primer5.0和Olig06.0进行引物设计与评估,从火炬松8个样品的叶绿体基因组中扩增ycf1基因,将8个PCR产物进行测序,序列比对,以此检测8个亲本的亲缘关系,结果表明:与202相比,2号样品有3个gap;3号样品有2个gap和一个碱基突变位点;4号样品无gap,但有3个碱基突变位点;5号样品有3个gap和1个碱基突变位点;6号样品有5个碱基突变位点;7号和8号样品的多态性位点一致,即分别有1个gap和2个碱基突变位点。表明ycf1基因在松树叶绿体基因中存在较大的变异性,可作为分辨种内个体多态性的依据。
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