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目的:急性心肌梗死作为常见的心血管疾病,严重威胁着人类的生命。大量研究表明,骨髓干细胞移植治疗心肌梗死,能明显修复受损的心肌,诱导新生血管形成,改善心功能。但仍然存在移植细胞早期大量丢失,移植时机选择等问题,限制了其临床应用。心肌梗死发生后,心肌组织缺血缺氧,大量有害的细胞因子和炎症介质被释放,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性被激活,可能是导致移植细胞大量死亡的主要原因。为此,我们通过动物实验,在心梗后不同时间点,将雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞移植至雌性大鼠心肌梗死模型内,观察移植细胞在梗死区的存活情况和心功能变化,探讨适合心梗后细胞移植治疗的最佳时间选择。并进一步通过实验观察心肌梗死后iNOS的表达变化规律,在此基础上,观察早期的iNOS抑制剂干预对移植细胞存活率及心功能的影响,明确其对移植细胞存活及心肌修复的作用,为干细胞移植治疗心肌梗死的临床应用提供必要的科学依据。方法:1、急性心肌梗死(AMI)模型的制备:取体重150-180g、雌性SD大鼠,采用永久性结扎冠状动脉前降支的方法制备AMI模型,根据细胞移植时间不同随机分组进行实验观察。2、骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养:取体重100～130g、雄性SD大鼠,使用全骨髓贴壁法分离、培养MSCs,并采用免疫细胞化学和流式细胞术对培养的MSCs进行鉴定。3、细胞移植:根据细胞移植时间点的不同行原位二次开胸,直视下将培养的MSCs(约1.2×106个)注射植入到梗死区中部心外膜下。4、移植细胞的定位检测:使用Hoechst33342和BrdU对移植的细胞进行标记,免疫组织化学检测与HE染色相对应,观察移植细胞在心梗区的定位及分布。5、移植细胞的定量检测:采用实时定量PCR检测雌性大鼠梗死区Y染色体性别决定区sry基因序列的表达,作为检测移植细胞存活率的定量比较指标。6、心功能的检测:细胞移植后4周,对实验大鼠行心脏超声检查。7、心梗区iNOS表达规律的检测:采用Western-blot检测心肌梗死后1h、3d、7d、10d、14d梗死区的iNOS表达情况。结果:1、MSCs鉴定:分离纯化的第四代MSCs经免疫细胞化学检测有CD29和CD44表达,无CD34表达,经流式细胞仪检测为CD44 +/ CD34 -,证明实验细胞为MSCs。2、心肌梗死模型:冠状动脉前降支结扎后,左室前壁变苍白,心脏膨大,左心耳充血,心室收缩减弱,与未梗死区界线清楚,表明心肌梗死动物模型制备成功。3、移植细胞存活情况和心功能观察:实验大鼠随机分为4组,心肌梗死(MI)组:心肌梗死后不进行MSCs移植,于心梗后4周行心功能检测作为对照;1h移植组:于心肌梗死后1h行MSCs移植,移植后立即取材作为Y染色体sry基因检测的对照标本;3d移植组:于心肌梗死后3d行MSCs移植;7d移植组:于心肌梗死后7d行MSCs移植。3d组和7d组均于移植后4周行心功能、移植细胞存活率及组织学检测。Real-time PCR检测心肌梗死后7d移植组MSCs存活率明显高于3d移植组,MSCs存活率分别为8.1%、2.5%(n=10,p<0.05)。心功能检测发现,在MSCs移植后4周,与MI组相比,3d移植组左室舒张末期内径(LVDd)和收缩末期内径(LVDs)无明显缩小,左室短轴缩短率(FS)和左室射血分数(EF)也无明显提高,两组无显著性差异(n=10,p>0.05)。而7d移植组在细胞移植后4周,LVDd和LVDs较3d移植组和MI组均有明显缩小,FS及EF也明显提高,与3d移植组和MI组相比具有显著性差异(n=10,p<0.05)。组织学检测发现,1h移植组:Hoechst33342标记及BrdU阳性的细胞主要分布于移植区域,细胞形态无变化;3d移植组:细胞移植后四周,梗死区Hoechst33342标记及BrdU阳性的细胞数量较少;7d移植组:在梗死区有大量的带有蓝色荧光的移植细胞分布,部分细胞聚集形成血管样结构。BrdU免疫组化染色及相应的HE染色同样发现在心肌梗死区有大量的移植细胞成团聚集,部分血管内皮可见BrdU阳性细胞,提示移植的MSCs在宿主心肌组织的存活、增殖,并可能参与梗死区新生血管的形成,促进心肌组织修复。4、心肌梗死后梗死区iNOS表达规律的观察:梗死心肌内iNOS的表达在心肌梗死后随即增加,在心肌梗死后第3天达到高峰,随后逐渐减少。在心梗后不同时间点梗死区iNOS表达强度的变化规律为: 3d>1h>7d>10d>14d(n=5,p<0.05)。5、iNOS抑制剂对移植细胞存活和心功能影响的观察:治疗组于细胞移植前12h给予选择性iNOS抑制剂1400W 2mg/kg,腹腔注射,2次/天,维持3天,四周后行心功能、移植细胞存活率及组织学检测,对照组以等量生理盐水代替。Real-time PCR检测显示1400W治疗组和对照组Y染色体sry基因序列的表达水平分别为4.2%、1.8%,结果表明,心肌梗死后第3天进行细胞移植并给予早期的iNOS抑制剂干预,移植细胞存活率可有明显提高(n=10,P<0.01)。组织学检测发现,对照组BrdU阳性细胞分布散乱,数量较少;治疗组中BrdU阳性细胞数量明显增多,且分布较集中。相对应的HE染色可见移植细胞的相似分布。然而,心功能检查在治疗组和对照组两组间无显著性差异(n=10,p>0.05)。实验结果说明iNOS抑制剂的早期干预可以在一定程度上提高心梗后3d移植组移植细胞的存活率,但对心功能却无改善作用。结论:1、心肌梗死后第7天进行MSCs移植,在移植细胞存活率和心功能的改善上均优于心肌梗死后第3天进行细胞移植。2、iNOS的表达高峰出现在心肌梗死后第3天,随后逐渐下降。3、iNOS抑制剂的早期干预在一定程度上提高了心梗后3d移植组移植细胞的存活率,但不足以引起心功能的改变。