癫痫是一种神经系统疾病,其特征在于中枢神经系统的兴奋性和抑制性神经递质失衡引起的神经元异常放电。其发病机制非常复杂,与神经递质失衡,氧化应激和免疫炎症关系密切。氧化应激会产生大量氧自由基,在正常的生理条件下,机体会利用和消除多余的自由基,然而,过量的有害刺激,如癫痫会导致组织和细胞缺氧,损伤甚至坏死。据报道,在海人酸(Kainic acid,KA)诱导的大鼠癫痫模型中发现氧化应激损伤,并分布在大脑的所有区域。过氧化物还原酶6(peroxiredoxin6,PRDX6)属于巯基特异性过氧化物还原酶家族中的一员,含有两个结构功能域,分别是具有抗氧化功能的过氧化物还原酶活性和促进炎症发生的非钙依赖性磷脂酶A2的活性。因此,PRDX6一方面能通过消除活性氧(reactive oxygen species,ROS),参与过氧化细胞膜的修复和细胞磷脂的转运,在抗氧化应激中发挥重要作用;另一方面,能通过其磷脂酶A2的活性促进炎症发生。2008年Myung-Jeom Ryu等人在Neurochem上发表了一篇关于stargazer(stg)突变小鼠表型的文章,该突变小鼠中表达钙通道γ2亚基stargazin的基因发生突变,表现出几种神经系统疾病的症状,包括自发性癫痫发作、小脑性共济失调和头部扭动。蛋白组学结果显示小鼠下丘脑中与氧化应激相关的两种蛋白:磷朊蛋白1和PRDX6表达水平均明显降低,但PRDX6是否参与癫痫的发病过程或发病机制未见报道。因此,本实验拟观察PRDX6在KA诱导的癫痫鼠中的表达变化、细胞定位并探讨其在癫痫发病中的可能作用机制,为癫痫的疾病机制研究和治疗药物靶点筛选提供理论基础和实验依据。目的:1.观察PRDX6在癫痫大鼠模型中的表达变化;2.观察PRDX6在癫痫鼠中的表达定位;3.探讨PRDX6在癫痫发病中的作用及其可能机制。方法:分别采用野生型和PRDX6敲除的SD大鼠侧脑室注射KA诱导癫痫模型,癫痫评分大于4分的作为成功模型入组,分别在注射KA后1天,3天,7天处死大鼠并留取脑组织样本。采用FJB染色(Fluoro-Jade B staining)检测神经元损伤情况;尼氏染色(Nissl staining)检测神经元功能损伤;免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)观察PRDX6在癫痫大鼠脑中的表达水平、脑区定位;免疫荧光(Immunofluorescence technique,IF)观察PRDX6的细胞定位。蛋白免疫印迹(western blot,WB)检测癫痫大鼠海马组织中PRDX6的蛋白表达情况;酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测癫痫大鼠血清中PRDX6水平;荧光定量-逆转录聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测癫痫大鼠海马组织中PRDX6以及其他过氧化物还原酶家族成员的m RNA水平、氧化应激相关因子、炎症相关因子的m RNA水平;转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)检测PRDX6敲除鼠癫痫模型海马中基因表达变化。结果:1.PRDX6在KA诱导的癫痫大鼠海马中表达上调根据大鼠癫痫评分等级,挑选4分及以上的癫痫大鼠入组,并分别在注射KA后的1天,3天,7天处死并留取脑组织样本。FJB染色显示,KA诱导的癫痫鼠神经元损伤严重,功能退化的神经元主要分布在海马CA3和CA1区;Nissl染色显示癫痫大鼠脑海马CA3和CA1区神经元缺失明显;IHC结果显示PRDX6在癫痫大鼠脑中的表达显著增多,且主要定位于海马和皮层,在侧脑室周围也有表达;WB显示癫痫大鼠海马组织中PRDX6的表达上调,在KA1d时开始增加,KA3d时表达显著上调,KA7d时仍维持较高水平;因PRDX6是分泌性蛋白,我们用ELISA检测血清中PRDX6水平,结果显示癫痫大鼠血清中PRDX6在KA3d明显升高;qRT-PCR的结果也显示,癫痫大鼠海马组织中PRDX6的m RNA水平在KA3d时显著增加。2.PRDX6在癫痫鼠脑中的星形胶质细胞中表达为了探究PRDX6的细胞定位,我们使用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)作为星形胶质细胞的标记物。PRDX6与GFAP免疫荧光共标结果显示,在大脑皮层、海马、侧脑室均存在PRDX6与GFAP的共定位,提示PRDX6表达在星形胶质细胞中。3.在KA诱导的癫痫鼠脑中,PRDX6不在小胶质细胞和神经元中表达我们使用离子钙接头蛋白-1(Ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)来标记小胶质细胞。免疫荧光双标结果显示,PRDX6与Iba-1没有共定位,表明PRDX6不在小胶质细胞中表达。神经元特异性核蛋白(Neural nuclei protein,Neu N)是成熟神经元的标记物,PRDX6与Neu N免疫荧光双标的结果显示,PRDX6和Neu N也没有共定位,提示PRDX6也不在神经元中表达。4.氧化应激相关因子i NOS和4-HNE均表达在癫痫大鼠脑星形胶质细胞中为了了解KA诱导的癫痫大鼠脑中是否存在氧化应激。我们使用免疫荧光双标检测氧化应激相关因子:诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)和4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)的细胞定位。结果发现,i NOS和4-HNE均表达在GFAP阳性细胞内。与PRDX6共定位,提示癫痫能诱导星形胶质细胞中氧化应激水平上调。5.PRDX6敲除能减少再发癫痫次数,降低死亡率,减轻神经元丢失我们采用PRDX6敲除鼠同前建立癫痫模型。与野生型鼠相比,PRDX6敲除鼠在KA给药后3小时内的癫痫评分无明显变化。但3h后的大鼠再发癫痫次数明显降低(P<0.05),死亡率也显著减少(P<0.001)。FJB染色和尼氏染色结果显示,PRDX6敲除鼠的海马区神经元丢失明显减轻。以上结果提示PRDX6敲除能减轻KA导致的癫痫大鼠海马神经元损伤。6.PRDX6敲除对KA诱导的癫痫鼠脑中胶质细胞的影响胶质细胞反应性增生并形成胶质瘢痕是癫痫的重要病理特征,为了了解PRDX6敲除对胶质细胞数量或增殖的影响,我们首先使用GFAP与Iba-1分别标记星形胶质细胞和小胶质细胞,比较在不造模的情况下,PRDX6对胶质细胞数量或增殖的影响。结果表明,仅PRDX6敲除对胶质细胞数量无明显影响。为了继续探究PRDX6敲除对癫痫大鼠胶质细胞的数量或增殖有无影响,我们采用增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)与GFAP或Iba-1共标,结果发现,PRDX6敲除鼠星形胶质细胞的数量无明显改变;而小胶质细胞数量明显低于野生鼠,且其增殖程度也降低。7.PRDX6敲除对海马氧化应激水平的影响PRDX6只是哺乳动物体内过氧化物还原酶家族中的一员,那么,PRDX6基因敲除是否会影响其他过氧化物还原酶的表达?为此,我们采用qRT-PCR首先检测了野生型和PRDX6敲除未造模组海马组织中其他PRDXs及氧化应激相关因子的m RNA水平,结果发现,PRDX6敲除后,PRDX1的m RNA表达下降,PRDX2及PRDX4的m RNA表达上调,海马中氧化应激相关因子无明显变化。之后,我们又检测了WT和PRDX6敲除鼠给予KA后3天海马组织中其他PRDXs及氧化应激相关因子的m RNA水平,结果发现,PRDX6敲除后,PRDX1基因的m RNA表达下降,PRDX5 m RNA表达上调,海马中氧化应激相关因子水平无明显变化。8.PRDX6敲除对海马炎症水平的影响为了探究PRDX6敲除对大鼠的炎症水平有无影响,我们使用qRT-PCR检测未造模组野生型和PRDX6敲除鼠海马组织中炎症相关因子的m RNA水平,结果发现,PRDX6敲除对海马炎症水平无明显影响;为了探究PRDX6敲除对癫痫大鼠的炎症水平有无影响,我们使用qRT-PCR检测给予KA后3天的野生型和PRDX6敲除鼠海马组织中炎症相关因子的m RNA水平,结果发现,PRDX6敲除对海马炎症水平无明显影响。同时,我们利用RNA-seq去筛选表达差异显著的基因,发现PRDX6敲除鼠中趋化因子CCL2和CCL7表达明显下调。结论:1.在KA诱导的大鼠癫痫模型中,海马区PRDX6显著上调;2.在KA诱导的癫痫鼠脑中,PRDX6特异性表达在星形胶质细胞中;3.过氧化物还原酶6敲除减轻癫痫大鼠海马区神经元损伤;4.PRDX6可能通过降低小胶质细胞的增殖,减少趋化因子的水平进而减轻癫痫过程中神经元的损伤。