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由于新型免疫抑制剂的开发利用，外科技术的进步，同种移植成功率逐年提高，器官移植成为挽救晚期心、肝、肾等器官的有效手段，供体器官的严重短缺已成为限制移植工作发展的主要障碍，从而促进了异种器官移植的研究和发展。异种器官移植对于人供体的缺乏来说是一种十分有效的解决方式，然而，异种器官移植所遇见的最大障碍之一是受者对异种器官的超急排斥反应(the hyperacute rejection，HAR)。HAR是由人体内针对异种组织内皮细胞的异种天然抗体所引起的，这些抗体与异种器官内皮细胞(EC)上的α-1，3Gal结合，通过经典途径和替代途径活化补体而对异种组织造成伤害。因此，解决异种器官移植的关键问题之一在于抑制补体介导的溶细胞作用。 补体调节蛋白(complement regulatory protein，CRPs)为一类存在于动物血清和多数细胞表面的糖蛋白，具有控制补体活性的作用。然而异种器官血管EC膜上的CRP由于种特异性，不能抑制人补体的激活，这是导致人体对异种器官发生HAR的重要原因。将编码人CRP的基因导入动物体内，建立相应的转基因动物，使动物的血管EC表达人的CRPs是抑制补体激活和控制HAR的有效方法，其中DAF和CD59作用于补体激活链式反应的不同环节，是目前研究应用最多的CRP。 目前认为双CRP基因转移较单基因能更有效的克服超急排斥反应，故分别构建了DAF和CD59载体，但非特异启动子会影响转基因动物的正常生理功能，故我们引入了血管内皮细胞特异表达ICAM-2启动子，我们还引入了内含子以增强目的基因的表达。这些特点和其它单位的研究不同，也是本实验工作的意义所在。 本实验组总的工作是建立DAF+CD59联合转基因猪的上游工作，分别构建了血管内皮细胞特异性高效表达DAF和CD59载体；培养猪的原代血管内皮细胞和成纤维细胞；转染构建基因，分别用报告基因和流式细胞计数法检测DAF和 9翌的郊和人ICAM七 于和相应堡因内含于在猪原代峭内皮绸胞内的 活性；测定DAF和CD59的蛋白功能活性。为以后建立DAF＋CD59联合转基因猪 的研究确立了必要的理论和实验技术基硼。 气龟—＿。。、L． 其中我侧重以下实验部分： 1、血管内皮细胞特异表达人DAF基因重组质粒的构建 PSFFVoAFCDNA质粒为美国华盛顿大学医学院内科研究室Kathy Lisezewski教授提供，该质粒包含全长人DAFcDNA，长度为1．86kb。从人全 血中提取人基因组 DNA，纯化后作为 PCR扩增人细胞粘附因子－2（intercellular adhesion molecule 2，ICAM－2）启动子片段和人 DAF第一个内含子（nitron－l） 片段的模板。根据基因库己报道的人ICAM－二启动子和人DAF nitron－l序列 分别设计了两对引物。人 ICAM－2 启动子引物序列（PI 5’GCTCTAGACATGACTCCAACAATG 3’，PZ 5’GAGGTACCTTCTCTGGCAGTCTC 3’）。人 DAF nitron－l启动子引物序列（P3 5’CGAGGTACCTGACTTACTGCAACT 3’P4 5’ GGACCTACTCAGGGTGGTAAAGT 3’）。为了便于克隆，在PI的 5’端加有 Xbal 酶切位点，在PZ、P3的5’端加有冲 酶切位点。PCR扩增扩增这两个片段 后，用相应的限制内切酶分别酶切PSFFV－DAF质粒和PCR扩增片段产生定 向克隆酶切位点接头，用T4连接酶先后连接定向克隆酶切位点接头，将以上 片段连接克隆到PGEM－7Zf质粒中，得到目的血管内皮细胞特异表达质粒。经 过酶切分祈和重组DAF基因片段的碱基序列测定，结果和设计一致。 基因组DNA的纯度浓度是影响PCR成功扩增的夫键因素。通过PCR获 得目的基因片段，具有快速、稳定、简便和产量大等优点。定向克隆提高了连 接效率，缩短了实验时间。 二、血管内皮细胞特异表达人CD59基因重组质粒的构建 CD59cDNA巾cDNA3质粒为美国Yle大学医学院提供，该质粒包含全长 人CD59CDNA，长度为476hp。利用上一步获得的纯化后的人基因组DNA作 二 为 PCR扩增人细胞粘附因子－2（ntercellular adhesion molecule 2，ICAM－2）启 动子片段和人CD59 内含子（intronl）片段的模板。根据基因库己报道的人 ICAM－2启动子和人CD59 intronl序列分别设计了两对引物。人ICAM－2启动 子 引 物 序 列：PIS’AThCGCGAGGCATGACTCCAACAATGC3’ PZ 5’TGCAAGCTTATCTCTGGCAGTCTCCACG3’。人 CD59 nronl 引物 序 列：P3 5’CGAGATCTAGCAGGCTGTAGGTTTCAGAG3’ P4 5’ATCGCGACTCCCAACTCCAATCCTACATC 3’。为了便于克隆，在 PI 的5端加有Bglll酶切位点，在PZ的、P3的5’端加有Nrul酶切位点，P4端 加有 Hindlll酶切位点。PCR扩增这两个片段后，分别和 T－vector连接，转化 受体菌，用兰白斑培养基筛选