低浓度脂多糖刺激对小鼠骨髓间充质干细胞炎性因子时序性表达的研究

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目的:小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs)由分离小鼠骨髓基质所得,该类细胞具有分泌多种细胞因子的能力,其作为一种极具潜力的细胞模型,被广泛用于体外免疫反应的研究。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为细菌胞壁固有成分,被广泛用于炎症模型的诱导。本实验旨在研究小鼠BMSCs在体外LPS刺激下炎性因子的分泌状态并对影响其分泌炎性因子的原因进行初步的探讨。方法:全骨髓贴壁法原代培养小鼠BMSCs,流式细胞术鉴定细胞表面CD34、CD29和CD44的表达,使用CCK-8法测定其生长曲线,并研究不同浓度LPS对BMSCs增殖-毒性的影响,从而确定LPS体外诱导BMSCs炎性环境的适宜浓度。使用RT-q PCR法研究LPS诱导的炎性环境下,BMSCs在不同时间点内(第1h、4h、8h、24h、3d、7d)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和ARG-1的m RNA表达情况,使用Western-Blot法研究LPS诱导的炎性环境下,BMSCs在不同时间点内(第1h、8h、24h)TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白的表达情况,使用ELISA法研究LPS诱导的炎性环境下,BMSCs上清中不同时间点内(第1h、4h、8h、24h、3d、7d)TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白的分泌情况,进而探究LPS诱导的体外炎性环境对BMSCs炎性因子时序性表达的影响及其可能的原因。结果:所得BMSCs的形态主要为梭形和多角形,其生长曲线呈明显“S”形。流式细胞术结果为细胞表面CD34(-)、CD29(+)、CD44(+),CCK-8结果显示不同浓度LPS化学刺激对BMSCs无明显毒性作用,且LPS的浓度与BMSCs的增殖间可能存在剂量依赖的关系。0.1、1、10ug/m L的LPS刺激对BMSCs的增殖均具有促进作用,其中1ug/m L的LPS刺激对促进BMSCs增殖的效果最明显,随着浓度增大,BMSCs的增殖活性呈现下降趋势,RT-q PCR结果显示不同时间点TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ARG-1 m RNA的表达均产生明显变化(P<0.05),随着刺激时间的延长,基因表达上调的趋势逐渐下降,IL-10和IL-1β的表达在第8h达到最大,TNF-α、IL-6、ARG-1分别在第1、4、24h达到最大,其中ARG-1基因在第4h的表达下调。ELISA的结果显示,TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白的表达随着时间的延长呈现先升后降的趋势(P<0.05),其中TNF-α蛋白在第8h达到峰值,而IL-1β、IL-10在第3d达到峰值。Western-Blot的结果显示,在1~24h,细胞IL-1β、TNF-α蛋白的表达均先升后降,IL-10蛋白的表达持续上升(P<0.05),其中IL-1β、TNF-α蛋白的表达在第8h达到最大,而IL-10蛋白的表达在第24h达到最大。结论:全骨髓贴壁法培养得到的小鼠BMSCs具有良好的增殖能力,并高表达骨髓干细胞表面标志,适宜浓度的LPS刺激对BMSCs无毒性作用,并且能够适当促进小鼠BMSCs的增殖。1ug/m L的LPS刺激上调了BMSCs促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达,也上调了抑炎因子IL-10的表达,不同因子的表达在时间上存在先后顺序,这可能与BMSCs通过自身免疫调节作用分泌细胞因子来调节炎症过程有关。
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