【摘 要】
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卵母细胞体外成熟是哺乳动物胚胎体外生产的关键步骤。相比体内低氧稳定的环境,卵母细胞在体外成熟过程中,不可避免的接触体外高氧环境造成氧化应激,影响卵母细胞成熟质量。氧化应激会影响卵母细胞减数分裂恢复,造成线粒体功能障碍,细胞内Cathepsin B水平增加,诱导卵母细胞凋亡并损害植入前胚胎发育。卵母细胞质量对于植入前胚胎发育至关重要。为了提高体外胚胎生产效率,抗氧化剂已广泛应用到体外成熟中。PPAR
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卵母细胞体外成熟是哺乳动物胚胎体外生产的关键步骤。相比体内低氧稳定的环境,卵母细胞在体外成熟过程中,不可避免的接触体外高氧环境造成氧化应激,影响卵母细胞成熟质量。氧化应激会影响卵母细胞减数分裂恢复,造成线粒体功能障碍,细胞内Cathepsin B水平增加,诱导卵母细胞凋亡并损害植入前胚胎发育。卵母细胞质量对于植入前胚胎发育至关重要。为了提高体外胚胎生产效率,抗氧化剂已广泛应用到体外成熟中。PPARγ被认为是一种新兴的抗氧化因子。PPARγ通过结合和配体激活发挥生理作用。罗格列酮（RSG）作为特异性PPARγ激动剂,因其具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等细胞活性受到越来越多的关注,但在动物生殖领域特别雌性配子发育过程中具体作用鲜有研究。在本研究中,以昆明小鼠为实验动物模型,在M16成熟培养基中添加RSG,探究RSG对小鼠卵母细胞成熟质量的影响。为探究RSG对小鼠卵母细胞成熟质量的影响,本试验将收集GV小鼠卵母细胞随机分为两组,Control组和RSG组,向M16培养基中添加0、20μmol/LRSG,在饱和湿度、38.5℃、5%CO2环境下培养至成熟并统计其成熟率。使用免疫荧光染色法,检测了卵母细胞内ROS和GSH水平,线粒体膜电位（MMP）,Cathepsin B活性。使用实时定量PCR（q RT-PCR）检测了卵母细胞内抗氧化和凋亡相关基因m RNA转录水平。为进一步验证RSG对卵母细胞质量的影响,本试验对成熟卵母细胞进行体外受精并培养至囊胚。通过免疫荧光染色检测2-cell内ROS和GSH水平,检测线粒体膜电位强度,使用Hoechst33342对囊胚进行核染色统计其囊胚内细胞中总数,通过TUNEL法计算囊胚内凋亡细胞比率,使用实时荧光定量PCR检测了囊胚内凋亡相关基因转录水平。结果显示,相比于Control组,RSG组卵母细胞成熟率显著提高（P＜0.05）;RSG组的ROS水平显著降低（P＜0.05）,GSH水平显著提高（P＜0.05）;JC-1结果显示,与Control组相比,RSG组线粒体膜电位显著提高（P＜0.05）;与Control相比,RSG组卵母细胞内Cathepsin B水平显著降低（P＜0.05）。q RT-PCR结果显示,RSG组抗氧化相关基因Sod-2、Cat和GPx-3 m RNA转录水平相比于Control组均显著提高（P＜0.05）;RSG组抗凋亡基因Bcl-2 m RNA转录水平显著提高（P＜0.05）,促凋亡基因Caspase-3和Bax m RNA转录水平显著降低（P＜0.05）。体外受精后,相较于Control组,RSG组分裂率和囊胚率均显著提高（P＜0.05）;与Control组相比,2-cell内ROS水平RSG组显著降低（P＜0.05）,GSH活性显著提高（P＜0.05）;与Control组相比,RSG组囊胚内细胞总数显著提高（P＜0.05）,囊胚内细胞凋亡比率显著降低（P＜0.05）;q RT-PCR结果显示,RSG组囊胚内抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl表达水平显著提高（P＜0.05）,促凋亡基因Caspase-3表达水平显著降低（P＜0.05）。本研究表明,在体外成熟期间添加RSG,可显著降低小鼠卵母细胞内ROS水平,提高了GSH活性,改善线粒体功能,降低卵母细胞内Cathepsin B水平,提高了卵母细胞抗氧化抗凋亡能力,显著提高小鼠卵母细胞体外发育能力。
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