【摘 要】
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牛卵母细胞体外成熟是牛胚胎移植前的关键步骤,而如氧化应激等体外环境因素抑制着牛卵母细胞的成熟。卵母细胞在体外培养过程中,由于失去机体自身防御系统,在体外成熟的过程中,过量的活性氧会对卵母细胞成熟产生不利的影响。而卵母细胞成熟的质量则直接关乎到后续胚胎的发育。在胚胎发育过程中,往往会伴随着“发育阻滞”现象的发生,氧化应激被认为是引起胚胎发育阻滞的重要原因之一,如果体内氧化还原系统失衡,活性氧（ROS
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牛卵母细胞体外成熟是牛胚胎移植前的关键步骤,而如氧化应激等体外环境因素抑制着牛卵母细胞的成熟。卵母细胞在体外培养过程中,由于失去机体自身防御系统,在体外成熟的过程中,过量的活性氧会对卵母细胞成熟产生不利的影响。而卵母细胞成熟的质量则直接关乎到后续胚胎的发育。在胚胎发育过程中,往往会伴随着“发育阻滞”现象的发生,氧化应激被认为是引起胚胎发育阻滞的重要原因之一,如果体内氧化还原系统失衡,活性氧（ROS）的浓度超出细胞的清除能力,会引起脂质过氧化、细胞信号蛋白氧化修饰、DNA链断裂等,这均可对卵母细胞及胚胎造成严重后果。柠檬苦素（Limonin,Lim）是一种高度氧化的四环三萜类化合物,是柑橘果实中苦味的主要来源。因其具有抗肿瘤活性、抑菌抗病毒、神经保护、抗氧化活性等作用,越来越受到众多研究者的关注。但柠檬苦素对哺乳动物生殖方面的影响未见报道。本研究中,以牛卵母细胞为研究对象,首次以柠檬苦素作为抗氧化剂添加到牛卵母细胞体外成熟培养体系中,旨在探究柠檬苦素对牛卵母细胞体外成熟的影响,为优化卵母细胞体外培养体系,提高胚胎移植效率提供理论依据。试验一:柠檬苦素对牛卵母细胞体外成熟的影响通过不同浓度（0μM/L、10μM/L、20μM/L、50μM/L）Lim处理后发现,20μM/L Lim处理组卵母细胞发育至MII期的比率显著高于其他三组（P＜0.05）。50μM/L Lim处理组发育至MII期的比率显著低于其他三组（P＜0.05）。对照组8-细胞率与10μM/L的Lim处理组无显著差异（P＞0.05）,但显著低于20μM/L的Lim处理组（P＜0.05）。对照组中囊胚率与10μM/L的Lim处理组无显著差异（P＞0.05）,但显著低于20μM/L的Lim处理组（P＜0.05）。此外,与对照组相比,Lim处理组的卵母细胞的ROS水平显著降低（P＜0.05）,谷胱甘肽（GSH）水平显著升高（P＜0.05）,通过RT-q PCR检测牛卵母细胞中抗氧化及凋亡相关基因的m RNA表达量,发现对照组中SOD1、SOD3、SIRT2及SIRT3等抗氧化相关基因的m RNA的表达显著低于Lim处理组（P＜0.05）。与对照组相比,Lim处理组卵母细胞的线粒体膜电位（ΔΨm）水平显著提高（P＜0.05）。相比于对照组,Lim处理组卵母细胞的组织蛋白酶B（CB）活性显著降低（P＜0.05）。与对照组相比,Lim处理组中Caspase-3及Bax等促凋亡基因的m RNA的表达显著降低（P＜0.05）,Survivin抗凋亡基因的m RNA的表达显著升高（P＜0.05）。综上所述,Lim能够有效缓解氧化应激对卵母细胞的损伤,维持线粒体功能,抑制细胞凋亡,提高卵母细胞成熟质量,提高卵母细胞的发育能力。试验二:柠檬苦素对牛早期胚胎发育的影响本试验旨在探究Lim对牛早期胚胎发育的影响机制,将经过Lim处理后的牛卵母细胞体外受精发育至8-细胞期胚胎或囊胚。通过对8-细胞期胚胎免疫荧光染色,发现对照组中ROS水平显著高于Lim处理组（P＜0.05）,GSH水平显著低于Lim处理组（P＜0.05）,对照组中SOD-1、SIRT-2和GPX-1等抗氧化相关基因m RNA表达量显著低于Lim处理组（P＜0.05）;相比于对照组,Lim处理组中ΔΨm水平显著提高（P＜0.05）。相比于对照组,Lim处理组中合子基因组激活相关基因Oct-4、Cox-2、Sox-2的m RNA表达量均显著提高（P＜0.05）。与对照组相比,Lim处理组囊胚内细胞数显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）,而对照组中,Bax促凋亡基因m RNA表达量显著高于Lim处理组（P＜0.05）,BCL-2与Survivin等抗凋亡基因的m RNA表达显著低于Lim处理组（P＜0.05）。综上所述,Lim能够通过缓解氧化应激对早期胚胎的损伤,维持线粒体膜电位,抑制细胞凋亡,上调合子基因组激活相关基因的表达,提高早期胚胎的发育能力,提高囊胚质量。综上,本研究表明Lim能够有效缓解牛卵母细胞体外成熟过程中的氧化应激损伤,提高牛卵母细胞体外成熟质量,促进早期胚胎的发育。
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