在所有恶性肿瘤中食管癌是导致病人死亡的第六位病因，该病是目前应用传统治疗方法最难治愈的恶性肿瘤之一。令人担忧的是，尽管在过去的几十年里食管癌的治疗已经采用了以侵入性外科手术为中心的多模式治疗策略，但病人的总体生存率没有得到实质性的改善。目前，食管癌的发病率与死亡率几乎相等，这说明现在该病的治疗方法是不成功的，现在急需一种新的治疗策略来改变这种局面。以腺病毒为基础发展起来的载体被广泛应用于肿瘤的基因治疗策略之中，然而，肿瘤基因治疗的成败取决于它的特异性及有效性。为了达到以上目的，近年研发的条件复制型腺病毒给肿瘤基因治疗提供了新的平台。依据条件复制型腺病毒的设计理念，我们在既往的工作中应用RAPAd.I载体系统，整合了肿瘤特异性启动子PEG-3p和肿瘤特异性抗癌基因Apoptin成功构建了具有肿瘤特异性启动复制及肿瘤特异性杀伤功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP（Ad-PEG-3p-E1a-Apoptin），而且在实验中观察到了Ad-VP这种条件复制型腺病毒比复制缺陷型重组腺病毒Ad-Apoptin及Ad-EGFP更有效力。细胞凋亡是一种生理性的、程序化的细胞主动消亡过程，这种自主的细胞死亡过程除去了正常组织中多余或者衰老无效的细胞，从而保证了机体的正常代谢和功能。在人类许多恶性肿瘤组织中细胞凋亡时常发生，因此，诱导肿瘤细胞凋亡可能是一种强有力的肿瘤治疗方法。Apoptin来自于鸡的贫血因子，它具有不依赖于p53基因，不能被Bcl-2基因抑制的方式诱导多种人类癌症细胞发生凋亡，其中包括肝细胞癌、恶性淋巴瘤、胆管上皮细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌以及大肠癌等。值得欣喜的是，Apoptin对正常的非转化细胞却没有凋亡诱导作用，比如：成纤维细胞、角质形成细胞以及平滑肌细胞等。Apoptin特异性肿瘤凋亡诱导功能的机制虽然没有完全阐明，但与caspase-3活化有关。Apoptin特异性肿瘤凋亡诱导功能与其亚细胞定位有关，正常细胞中Apoptin主要位于细胞质当中，而在转化细胞之中主要在细胞核中定位。有意思的是，caspase上游的抑制因素或者p53的缺失没有阻止Apoptin的凋亡诱导功能，而且抗凋亡基因Bcl-2、BAG-1以及Bcr-Abl也不能抑制Apoptin的凋亡诱导功能。并且因为VP3基因体积很小可以很容易插入到乳多泡病毒、腺病毒等多种病毒的基因组内，以上这些优点提示Apoptin在未来的肿瘤基因治疗中会很有潜力。PEG-3p是PEG-3启动子的最小功能单位。有研究表明，PEG-3p能够在人类肝癌细胞HepG-2、肺癌细胞A549以及宫颈癌细胞HeLa中驱动基因表达，而这种驱动作用在正常的人胚肺细胞WI-38及非洲绿猴肾细胞Vero中却不起作用。近年来，以溶瘤腺病毒为基础的癌症基因治疗在临床前及临床试验中有了广泛的研究。我们先前构建了双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP（Ad-PEG-3p-E1a-Apoptin），本实验即应用Ad-VP作用于人食管癌EC-109细胞，在体外通过MTT分析发现在感染剂量为100MOI的条件下，72小时Ad-VP达到了杀伤作用的顶峰，而在1MOI或10MOI时，肿瘤抑制作用明显降低。这说明Ad-VP对EC-109细胞杀伤作用具有剂效及时效关系。相反，这种关系在Ad-Apoptin和Ad-EGFP感染的实验中却没有体现。进一步的AO/EB,DAPI和Annexin V染色分析证明了Ad-VP对EC-109细胞具有明显的杀伤作用。而Ad-VP感染的正常人胚肝细胞L02却没有受到抑制。线粒体途径是细胞凋亡的重要信号通路，细胞凋亡时通常会发生线粒体跨膜电位的丧失，并导致细胞色素C的释放。而且，caspases的活化在细胞凋亡过程中起到核心的作用，无论外源性凋亡途径还是内源性凋亡途径，均通过caspase酶达成凋亡效果。本研究还进一步探讨了Ad-VP诱导凋亡的途径。结果表明，Ad-VP感染EC-109细胞后，造成EC-109细胞线粒体膜电位下降和细胞色素c释放。同时，Ad-VP感染还导致caspase酶活化及caspase酶底物裂解。然而，Ad-VP感染L02细胞后，对线粒体膜电位、细胞色素c和caspase酶均无影响。研究表明，Ad-VP通过线粒体途径诱导了EC-109细胞凋亡，caspase-3、-6和-7在此过程中发挥了重要作用。本研究的动物实验表明，瘤内注射Ad-VP可以显著抑制肿瘤的生长并提高了荷瘤动物的生存率，但是没有彻底消灭荷载的肿瘤，以上结果补充了体内研究的实验数据。总之，双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP诱导EC-109细胞发生了显著的凋亡，而这种细胞凋亡诱导作用是通过caspases激活的线粒体途径实现的。Ad-VP在今后食管癌的临床基因治疗中可能会具有很大的潜力。