骨骼肌是参与自主运动、能量代谢和分泌的重要组织,也是家畜肉产品的重要组成部分,其生长发育很大程度上决定了肉的产量和品质,对畜牧业的经济效益有重要影响。骨骼肌的生长和发育受到基因、非编码RNA、转录因子等众多因素的调节,其中生肌调节因子（MRF）起着决定性的作用。多形性腺瘤基因1（PLAG1）编码一种转录因子,参与动物的生长和发育等多种生命活动。但有关PLAG1是否参与肌肉发育的相关研究非常有限,其功能与分子机制尚不清楚。本研究以秦川牛为研究对象,采用现代分子生物学及生物信息学方法,对PLAG1基因的功能及其调控机制进行了研究,结果如下:1、牛PLAG1基因多态性及其与黄牛生长性状关系的研究本研究通过PCR-RFLP技术,在秦川牛、郏县红牛、夏南牛、皮南牛、吉安牛共646个体里鉴定出g.48308C＞T突变位点,进一步的关联分析发现g.48308C＞T位点对秦川牛、郏县红牛和夏南牛的体高有显著影响（P＜0.05）。在郏县红牛和夏南牛中,TT型个体的体高显著低于TC型和CC型个体（P＜0.05）,且TC和CC型个体体高均无显著差异（P＞0.05）。该位点对于皮南牛、秦川牛和郏县红牛的胸围具有显著影响（P＜0.05）。在皮南牛、秦川牛和郏县红牛中,TC型个体的胸围显著高于TT型个体（P＜0.05）。该突变也同样与秦川牛、郏县牛、夏南牛的体长显著相关,且TT型体长显著低于TC型及CC型（P＜0.05）。皮南牛、秦川牛和夏南牛的十字部高也同样受到突变位点的影响,TT型的十字部高最低（P＜0.05）。结果表明,该多态位点与牛的体高、胸围、体长和十字部高有关,从而影响牛的生长性状。2、秦川牛PLAG1基因不同转录本及其表达规律检测本研究通过PCR及测序鉴定出PLAG1基因的4种转录本,通过RT-q PCR发现PLAG1基因在胚胎期表达量更高,在胚胎期心脏、肾脏和骨骼肌中表达量相对较高;在成年牛各组织中检测到相对于胚胎期较低的表达量,但是在成年心脏、脾脏和骨骼肌表达量相对较高。分析PLAG1不同转录本在肌肉的表达发现,PLAG1-X3和-X4转录本表达规律与PLAG1基因总体表达规律一致,其中PLAG1-X4在胚胎骨骼肌组织中的表达显著高于成年牛骨骼肌组织。PLAG1-X2和PLAG1-X5转录本在成年牛骨骼肌中的表达高于胎牛骨骼肌中,其中PLAG1-X2在成年牛骨骼肌的表达显著高于胚胎肌肉组织（P＜0.05）。此外,PLAG1基因的氨基酸序列在反刍动物中进化距离最近,在人、鼠、牛等多个物种中保守性较高;蛋白互作分析发现,PLAG1蛋白与NCAPG、LCORL、MSTN、CHCHD7、HMGA2和IGF2等22种肌肉发育相关蛋白存在强交互关系,且m RNA表达趋势相同。这些结果表明PLAG1可能参与调控牛的骨骼肌发育。3、PLAG1调控原代成肌细胞增殖、凋亡和肌损伤修复的功能研究将PLAG1的过表达载体或siRNA转染进牛原代成肌细胞进行功能获得性试验以及功能缺失性试验,使用CCK-8检测细胞活力、Ed U检测增殖细胞比例、RT-q PCR检测PCNA m RNA表达变化、Western blot检测PCNA蛋白表达变化以及流式细胞技术检测细胞周期变化,结果显示过表达PLAG1能够增加细胞活力、增殖细胞的比例、增殖标志基因PCNA的表达以及S期细胞比例,表明PLAG1能够促进牛原代成肌细胞增殖。使用RT-q PCR、Western blot检测过表达或抑制PLAG1后凋亡标志基因Bcl-2的表达变化,发现PLAG1能够抑制Bcl-2的表达。使用流式细胞技术结合Annexin V-FITC/PI双染法和JC-1线粒体膜电位检测发现过表达PLAG1能够减少凋亡细胞的比例。这些结果表明PLAG1能够抑制牛原代成肌细胞的凋亡。通过心脏毒素诱导肌肉损伤,然后过表达PLAG1并检测其对肌损伤修复的影响,发现PLAG1能够上调PAX3、PAX7、Cyclin D1和CDK2的表达,表明PLAG1发挥了促进肌损伤修复的作用。4、PLAG1调控原代成肌细胞增殖和凋亡的机制研究通过染色质免疫沉淀测序（Ch IP-seq）将能够与PLAG1蛋白结合的基因片段富集并进行分析,发现注释到的基因可以富集到PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、c AMP信号通路等,其中PI3K-AKT信号通路富集到的基因最多,为122个。Western blot表明,PLAG1能够通过上调PI3K-AKT信号通路中的p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、Cyclin D1和CDK2的表达,以及抑制p21和p27的表达来促进牛原代成肌细胞增殖;并通过抑制BAD的表达来释放Bcl-2和Bcl-x L,进而抑制牛原代成肌细胞凋亡。5、miR-1介导的PLAG1与PI3K-AKT信号通路之间的正反馈转录调控使用LY294002或740 Y-P来抑制或激活PI3K-AKT信号通路,发现PLAG1的表达量随之下降或上调,表明PLAG1和PI3K-AKT信号通路可能存在正向反馈调节。PLAG1启动子区的大量Cp G岛表明DNA甲基化可能参与介导这种正向反馈调节,但亚硫酸氢盐测序PCR证实DNA甲基化不参与该反馈调节。通过双荧光素酶报告检测发现,miR-1能够靶向PLAG1,而miR-1充当了PLAG1和PI3K-AKT信号通路之间反馈调节媒介。PLAG1通过促进PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平来激活PI3K-AKT信号通路,进而抑制下游Fox O3的蛋白水平。转录因子Fox O3能够促进miR-1的转录,而Fox O3的减少导致miR-1表达量降低,从而释放靶基因PLAG1,这构成了一个闭合的正反馈调节回路。6、外泌体miRNA调控PLAG1的研究通过电镜和粒径分析鉴定到牛原代成肌细胞释放的外泌体,并利用测序检测到36个外泌体miRNA,其中exo-bta-miR-10a、exo-bta-miR-122、exo-bta-miR-451、exo-bta-miR-486在外泌体内的表达量高于细胞内表达量,另外32个外泌体miRNA的表达量低于其在细胞内的表达量。双荧光素酶报告检测发现miR-181a不仅能在细胞内靶向PLAG1,还可能被转运到外泌体中调控受体细胞内PLAG1的表达,这为PLAG1的调控模式提供了新的思路。本研究较为系统地研究了PLAG1对秦川牛骨骼肌生长发育的影响,研究内容涉及PLAG1基因的SNP位点对黄牛生长性状的影响、PLAG1基因转录本的鉴定及表达分析、PLAG1对秦川牛原代成肌细胞增殖、凋亡的影响及其与PI3K-AKT信号通路作用的调节机制,并探究了细胞内miRNA及外泌体miRNA对PLAG1的调控。这些发现加深了对PLAG1基因功能的认识以及对肌肉发育的理解,为后续的秦川牛育种提供了潜在的候选基因。