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筛查与口腔黏膜白斑(oral leukoplakia,OLK),OLK癌变和口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)发生相关的阳性表达基因,进一步探讨口腔白斑发生的分子机制,尝试建立OLK、OLK癌变倾向和OSCC的基因诊断的可行方法。采用SuperArray肿瘤基因芯片(OHS-802)检测口腔正常组织、口腔癌前病变组织和OSCC组织肿瘤相关基因的表达差异。进一步运用RT-PCR、Real Time PCR法的方法证实“正常组织→OLK组织→OSCC组织”连续递增2倍以上或递减2倍以下的基因。将这些基因作为OLK组织癌变的候选基因,解释与口腔癌前病变致恶变的发生、发展的关系。基因芯片实验采用化学发光检测试剂盒(SuperArray Bioscience,Catalog Number D-01),X-射线胶片曝光,使用芯片公司提供的综合型GEArray表达分析配套软件(GEArray Expression Analysis Suite)进行芯片数据分析。RT-PCR电泳结果采用Kodak凝胶成像分析系统对部分基因的表达水平进行半定量,然后将其与芯片分析的数据结果进行相似性分析。ACP-2、BCL-2、SOCS-3、CLK-3、CTNNB-1、FKBP-8、GDF-15、NF-1、XRCC-1等9个候选基因的表达量均与组织的癌变程度存在较好的线性关系,R2>0.8,提示这些基因表达变化可能是口腔正常黏膜组织经OLK转变为癌组织的驱动,可作为OLK组织、OSCC组织和口腔正常黏膜组织诊断的分子标志候选基因。本文研究内容包括:(1)OLK组织中肿瘤相关基因表达特点研究(2)OLK组织癌变标志性基因的筛查(3)标志性基因在口腔黏膜病基因诊断中的应用。1.OLK组织中肿瘤相关基因表达特点OLK、OLK癌变倾向和OSCC发生相关的阳性表达基因的研究是探讨白斑癌变的发生机制的重要基础。该部分内容根据组织间基因表达水平标准值的比值,将表达量上调2倍或下调2倍的基因确定为阳性候选基因。结果显示,在检测的440个肿瘤相关基因中有49个基因表达水平下调2倍以上,有157个基因表达上调2倍以上,共206个阳性基因,其分布于肿瘤发生的各个已知环节,提示这些基因表达变化可能是口腔粘膜组织白斑化和OLK癌化的驱动。OLK及其恶变,乃至OSCC的发生与细胞周期调控基因和细胞增殖分化基因关系密切,其中有53个基因在细胞周期调控方面的表达变化在两倍以上(上调或下调),有65个基因在细胞增殖分化方面的表达变化在两倍以上。经RT-PCR结果证实,正常组织和OLK组织间CTNNB-1、GDF-15、FKBP-8、NF-1四个基因的表达差异和SupperArray芯片获得的结果一致。实验还证实OLK组织和OSCC组织间,在口腔粘膜正常组织和OSCC组织间CLK-3、CTNNB-1、GDF-15、FKBP-8、SOCS-3、NF-1、BCL-2、XRCC-1、ACP-2九个候选基因的表达和SupperArray芯片结果一致。白斑发生的分子机制较为复杂,特别是与细胞周期调控基因和细胞增殖分化基因关系密切。本研究为深入研究口腔黏膜白斑的发生机制和标志性基因探针的筛查提供有价值的数据。2 OLK组织癌变标志性基因的筛查在对口腔正常组织、口腔癌前病变组织和OSCC组织的肿瘤相关基因表达差异的研究中发现,仅有3个基因(ACP-2、BCL-2、SOCS-3)表达水平连续下调2倍以上,有6个基因(CLK-3、CTNNB-1、FKBP-8、GDF-15、NF-1、XRCC-1)表达连续上调2倍以上,且ACP-2等9个标志性基因的表达量均与组织的癌变程度存在较好的线性关系,R2>0.8,提示这些基因表达水平的变化可能是口腔正常黏膜组织经OLK转变为癌组织的驱动基因。可作为OLK组织、OSCC组织和口腔正常黏膜组织诊断的分子标志。白斑癌变的分子机制较为复杂,与信号转导,DNA损伤与修复,癌基因与抑癌基因等多种作用机制相关。本研究为深入研究口腔黏膜白斑癌变的机制和标志性基因探针的筛查奠定了基础。3标志性基因在口腔黏膜病基因诊断中的应用目前,对OLK的诊断以组织病理学检查为主,该方法具有对患者的组织黏膜破坏面积大、诊断不准确的缺点。为了将候选基因用于口腔黏膜病中OLK,OLK癌变和OSCC的基因诊断,本研究对CLK-3、CTNNB-1、GDF-15、FKBP-8、SOCS-3、NF-1、BCL-2、XRCC-1、ACP-2等9个基因进行了RT-PCR半定量研究。采用两类Fisher判别法建立了口腔黏膜组织是否为OLK组织的判别公式为:Y=-27.503 +0.094XGDF-15 -0.122XNF-1+0.368XSOCS-3,确定了判别界值Yc=-1.186,即大于-1.186为非OLK组织,小于-1.186为OLK组织。采用Cross-validated(a)法进行验证性判别,总判别符合率为100%,交互判别符合率为100.00%,灵敏度为100%,特异度为100%。建立了口腔黏膜组织癌变趋势大小的判别公式:Y1=-16.811+0.477XNF-1+0.540XACP-2-0.543XCTNNB-1-0.089XSOCS-3;Y2=-35.832+0.073XNF-1-0.074XACP-2+0.306XCTNNB-1+0.191XSOCS-3。判别界值Yc1=8.6513;Yc2=0.1117,即大于8.6513可判断该组织为无癌变,介于0.1117和8.6513之间为轻度癌变组织,小于0.1117为癌变组织。进一步采用了Cross-validated(a)法进行了评价,总判别符合率为100%;交互判别符合率为100.00%,灵敏度为100%,特异度为100%。建立了口腔黏膜组织是否为OSCC组织的判别公式为:Y=-16.099+0.044XGDF-15-0.082XBCL-2+0.234XCTNNB-1,确定了判别界值Yc=0,即大于0为非OSCC组织,小于0为OSCC组织。采用Cross-validated(a)法进行验证性判别,总判别符合率为100%,交互判别符合率为91.67%,灵敏度为85.71%,特异度为100%。本研究为临床OLK、OSCC的基因诊断和口腔黏膜组织癌变趋势的基因诊断的建立提供了简便易行的操作方法。