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目的瘀血痹片是临床治疗瘀血阻络的痹证常用的中成药。本研究旨在基于网络药理学方法预测瘀血痹片活性化合物及作用靶点,通过动物实验验证瘀血痹片的抗炎作用及机制,并于体外通过基于环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）活性的生物效价检测方法评价瘀血痹片抗炎作用的生物质量。方法1、网络药理学方法:通过中药系统药理学数据库及分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）及中医药综合数据库（traditional Chinese medicine integrated database,TCMID）对瘀血痹片处方中的11味中药材筛选活性化合物,于Swiss Target Prediction数据库预测活性化合物的作用靶点,同时在Gene Cards数据库中挖掘炎症相关靶点,利用Venny 2.1获取瘀血痹片与炎症的交集靶点。将交集靶点上传至STRING 11.5数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络图,并经拓扑参数分析得到瘀血痹片抗炎作用关键靶点;将关键靶点于注释、可视化和集成发现数据库（database for annotation,visualization and integrated dscovery,DAVID）中进行基因本体论（gene ontology,GO）及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析,利用R语言将结果可视化。同时,通过Cytoscape 3.7.2构建“瘀血痹片-活性化合物-关键靶点”及“瘀血痹片抗炎作用通路-核心靶点”网络图并进行拓扑分析,预测瘀血痹片抗炎的关键活性化合物,并确定瘀血痹片抗炎作用机制研究的目的蛋白。2、动物实验方法:（1）造模方法:采用小鼠右后足趾皮下注射100μL角叉菜胶溶液（1%生理盐水溶液）进行致炎。（2）实验动物分组及给药:42只SPF级昆明小鼠随机分为7组:正常对照组、模型对照组,塞来昔布低、高剂量组,瘀血痹片低、中、高剂量组。各组小鼠给予对应药物连续灌胃给药7天。除正常对照组外,各组小鼠末次给药30 min后造模;正常对照组注射同体积生理盐水。（3）检测指标:在致炎前,及致炎后第2、4、6 h在同一位置测量小鼠右后足趾厚度,并计算各组小鼠足肿胀度;苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色法观察小鼠足爪的组织炎症细胞浸润情况;根据网络药理学预测结果,通过酶联免疫吸附（enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA）实验及蛋白质免疫印迹（western blot）法检测小鼠血清及足爪的软组织炎症相关目的蛋白的水平。3、生物效价检测方法:将供试品瘀血痹片和对照品塞来昔布胶囊以反应缓冲液溶解为不同浓度,分别得到瘀血痹片:40 mg/m L、20 mg/m L、10 mg/m L、5mg/m L、2.5 mg/m L,塞来昔布胶囊:1.0 mg/m L、0.5 mg/m L、0.25 mg/m L、0.125mg/m L、0.0625 mg/m L。采用ELISA法检测不同浓度瘀血痹片及塞来昔布胶囊在体外对COX-2酶活性的抑制作用,并计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。结果1、网络药理学研究发现,瘀血痹片抗炎作用关键靶点共56个,包括TNF、IL1B、IL6、PTGS2、RELA、MAPK1、MAPK8和MAPK14等,涉及到120个关键活性化合物,包括槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、肉豆蔻醚等。通过GO及KEGG富集分析发现,瘀血痹片抗炎作用的关键靶点参与的生物过程涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、NF-κB转录因子活性的正调节、一氧化氮生物合成过程的正调节、炎症应答等,富集的信号通路包括TNF信号通路、TLR信号通路、NF-κB信号通路和NOD样受体信号通路等。2、动物实验研究发现,与正常对照组比较,模型对照组小鼠因角叉菜胶致炎引起的足肿胀度显著升高,在第4 h达到高峰（P＜0.01）,HE染色观察足爪的组织可见大量炎症细胞浸润;与模型对照组比较,瘀血痹片高剂量组小鼠足肿胀度在第6 h降低（P＜0.05）,瘀血痹片中、高剂量组可见炎症细胞浸润明显减少。验证网络药理学预测的靶点结果显示,与正常对照组比较,模型对照组小鼠血清中肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-6水平均显著升高（P＜0.01）,足爪的软组织中COX-2表达及核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）、p38磷酸化水平上调（P＜0.05）;与模型对照组比较,瘀血痹片各剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低（P＜0.05）,足爪的软组织中COX-2表达及NF-κB p65、p38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）的磷酸化水平下调（P＜0.05）。3、生物效价检测结果发现,瘀血痹片及塞来昔布胶囊对COX-2酶活性均具有抑制作用,呈一定的剂量依赖关系。瘀血痹片对COX-2酶的IC50为20.54 mg/m L,塞来昔布胶囊对COX-2酶的IC50为0.4931 mg/m L。结论瘀血痹片具有抗炎作用,其机制可能与抑制NF-κB p65、JNK、p38的磷酸化,下调COX-2的表达,降低TNF-α、IL-1β、IL-6的水平有关。体外基于COX-2酶活性的瘀血痹片生物效价检测方法可用于评价瘀血痹片抗炎作用的生物质量。