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布鲁氏杆菌病是由动物或人感染布鲁氏杆菌后引起的一种人兽共患的传染性疾病,可使患者浑身关节钝痛,肌肉酸痛并长期发热,多汗等。人感染布鲁氏杆菌病通常是由动物传染的,目前对于动物的布鲁氏杆菌病的防控方案主要是以预防为主,淘汰阳性动物。接种疫苗是一种有效的预防布鲁氏杆菌病的措施,而当前我国市面上的布鲁氏杆菌病疫苗均为弱毒苗,布鲁氏杆菌病的弱毒苗仍然可以对畜牧养殖场的工作人员或实验室的操作人员造成感染,而且疫苗株仍残余一定的毒力,母畜如果在孕期接种布鲁氏杆菌弱毒苗则同样会导致其流产,并且当前血清学检测的方法无法有效区分动物疫苗株免疫和野毒株感染引发的抗体反应。因此研制安全可靠且易鉴别的布鲁氏杆菌病疫苗成为了当前的重点研究方向。本实验以Omp16(BMEI0340)基因为研究靶点,首先对其ORF区设计引物并进行PCR扩增,连接到p ET-28a载体上后转入BL21感受态中,构建出Omp16的原核表达菌株,经SDS-PAGE和western blot验证后进行纯化得到Omp16蛋白待后续使用。再设计引物对Omp16基因(BMEI0340)的上下游序列进行PCR扩增,在y TREX-Sac B质粒基因序列上选取kan抗性序列片段设计引物扩增,采用融合PCR的方法将三段基因拼接后连接到p MD18-T载体上并电转化到B.abrotus A19疫苗株中与其基因组发生同源重组,以kan抗性基因替换掉Omp16基因构建出A19-ΔOmp16缺失突变株。将A19-ΔOmp16缺失突变株连续传代24代后隔代进行PCR检测,发现无回复性突变。将A19-ΔOmp16缺失突变株置于不同的外界环境中进行应激能力检测,发现在缺失掉Omp16基因后可能由于膜结构的改变,菌体对外界环境的耐受力整体弱于B.abrotus A19亲本株。将A19-ΔOmp16缺失突变株和B.abrotus A19亲本株分别感染Raw264.7小鼠巨噬细胞和六周龄的雌性Balb/c小鼠,比较其在巨噬细胞和小鼠体内的存活能力以及对小鼠的毒力。巨噬细胞攻毒实验的结果显示在攻毒后的不同时间点内,A19-ΔOmp16缺失突变株的含量均少于B.abrotus A19亲本株。小鼠感染实验结果则显示,A19-ΔOmp16缺失突变株接种的小鼠在不同时间点的脾指数以及脾脏载菌量均低于B.abrotus A19亲本株接种的小鼠。分别用A19-ΔOmp16缺失突变株和B.abrotus A19亲本株对小鼠进行免疫,之后用B.abrotus 2308强毒株攻毒,检测缺失株对小鼠的免疫保护力。经A19-ΔOmp16缺失突变株免疫的小鼠在攻毒后两周的脾指数和脾脏载菌量略低于B.abrotus A19亲本株免疫的小鼠,但差异并不显著。将之前纯化得到Omp16蛋白上样进行western blot实验来验证血清中的抗体,分别以B.abrotus A19亲本株接种的小鼠血清和A19-ΔOmp16缺失突变株接种的小鼠血清作一抗,HRP标记的山羊抗小鼠血清为二抗,经显色后结果显示以A19-ΔOmp16缺失突变株接种的小鼠血清作一抗的NC膜上没有出现条带,而以B.abrotus A19亲本株接种的小鼠血清作一抗的NC膜上呈现条带,说明经A19-ΔOmp16缺失突变株免疫的小鼠血清中不含有Omp16蛋白的抗体。上述实验结果表明本实验成功构建了可稳定遗传的A19-ΔOmp16缺失突变株,并且在缺失掉Omp16基因后菌体对外界环境的耐受力有所减弱,在巨噬细胞和小鼠体内的存活能力均有一定程度的降低,毒力有所减弱变得更为安全,而且可提供与亲本株相类似的免疫保护性,免疫的小鼠体内不产生Omp16蛋白的抗体,可用于进行疫苗免疫与野毒感染的区分,是一株很有前途的布鲁氏杆菌病候选疫苗株。