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随着科学的进步,临床综合治疗,包括新辅助放、化疗及生物治疗,基因疗法以及传统医学在治疗肿瘤方面已取得惊人进步,但从总体上看,目前多数恶性肿瘤的治疗效果及预后仍不佳,患者的5年生存率仍然很低。恶性肿瘤的发生与发展是多种因素影响的结果、长期的慢性炎症是胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等的重要致病因素,而细胞因子在此过程中发挥重要的作用。研究已证明,肿瘤细胞接受致炎因子(TNF-α、LPS等)刺激后产生的大量细胞因子白细胞介素-6(IL-6),与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移及抵抗化疗作用等预后不良密切相关。在查阅大量文献和原有工作的基础上,本研究应用RNA干涉(siRNA)、基因克隆、基因转染、重组腺病毒、Western blot、RT-PCR和ELISA技术,探讨有丝分裂原激活的蛋白激酶MEKK3在LPS刺激后的恶性肿瘤细胞所产生的IL-6中的作用,旨在为阐明恶性肿瘤细胞中LPS介导的IL-6产生的机制和发现可能的治疗药物作用的靶点奠定基础。卵巢癌、肺癌是高度恶性的肿瘤,而胃癌和乳腺癌则是我国或女性中最为常见的恶性肿瘤,我们首先应用LPS刺激这四种不同肿瘤细胞,检测其IL-6的产生水平,发现四种细胞均能产生不同浓度的IL-6,但以卵巢癌SKOV3和胃腺癌AGS产生的浓度较高,因此,选择SKOV3和AGS细胞进行研究。本研究第一部分首先应用ELISA方法检测胃腺癌AGS细胞和卵巢癌SKOV3细胞接受LPS刺激后IL-6的产生。结果表明:在接受LPS刺激后,AGS细胞和SKOV3细胞均能产生较高水平的IL-6。在此基础上,应用RT-PCR方法分别检测AGS细胞和SKOV3细胞接受LPS刺激后MEKK3基因表达的改变,以判断其是否是LPS信号途径的成分。RT-PCR结果显示:与未刺激的样本对比,两种细胞接受LPS刺激后,MEKK3mRNA表达均明显增加。RT-PCR结果表明:MEKK3可被LPS激活、MEKK3是LPS信号途径的信号分子,其接受LPS刺激后其mRNA表达的改变相似于文献报道的其他蛋白激酶因接受细胞因子刺激而活化后的基因表达的改变。以第一部分的结果为依据,本研究的第二、三部分着眼于探讨MEKK3是否参与LPS刺激后恶性肿瘤细胞所产生的IL-6的调控。本研究第二部分应用Genscript公司siRNA设计软件设计针对MEKK3基因编码区3个不同部位siRNA靶点、MEKK2基因编码区(因与MEKK3基因具有较高同源性,作为判断MEKK3发挥作用是否特异的对照)3个不同部位siRNA靶点及阴性对照siRNA靶点的模板DNA序列,合成与siRNA相应的DNA片段,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno腺病毒穿梭载体,将siRNA穿梭载体线性化后与骨架载体pADEasy-1在BJ5183菌中同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,以脂质体转染293A细胞包装形成具有感染能力的重组腺病毒颗粒,重组腺病毒在293A细胞中扩增。重组腺病毒颗粒扩增3-5个循环后进行病毒滴度和感染活力的测定。利用腺病毒质粒中所带绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)报告基因来验证转染成功。具有感染能力的MEKK3 siRNA、MEKK2 siRNA和阴性对照重组腺病毒颗粒感染(转导)SKOV3和AGS细胞,Western-blot检测并筛选出MEKK3和MEKK2蛋白表达最低的细胞株。结果发现,三个MEKK3 siRNA表达载体对MEKK3的表达均有抑制作用,其中pAdEasy-1-pRNAT-H1.1/A deno-MEKK3siRNA3(简称AD-MEKK3-siRNA3)的抑制作用最为显著,抑制率达89%。三个MEKK2siRNA表达载体对MEKK2的表达均有抑制作用,其中pAdEasy-1-pRNAT-H1.1/Adeno-MEKK2siRNA2(简称AD-MEKK2-siRNA2)的抑制作用最为显著,抑制率达75%。本研究第三部分分别应用RT-PCR和ELISA检测LPS刺激未转染的AGS和SKOV3细胞野生株、MEKK3低表达的MEKK3siRNA3/AGS和MEKK3 siRNA3/SKOV3细胞株、将MEKK3基因重新转染入MEKK3低表达的MEKK3 siRNA3/AGS和MEKK3siRNA3/SKOV3并经Western blot验证恢复了MEKK3表达的细胞、AGS和SKOV3siRNA阴性对照细胞株中IL-6的表达或产生。结果表明:MEKK3低表达的MEKK3siRNA3/AGS和MEKK3siRNA3/SKOV3细胞株IL-6mRNA的表达及IL-6的产生均明显低于野生株或阴性对照克隆株,差异非常显著(P均<0.01);此两细胞株恢复MEKK3表达后,其IL-6mRNA的表达和IL-6的产生得到了有效恢复且稍高于AGS经刺激的IL-6的浓度(P>0.05);MEKK2低表达的MEKK2siRNA2/AGS和MEKK2 siRNA2/SKOV3细胞株IL-6的产生与野生株相比,无显著性差异(p>0.05)。初步结果提示:MEKK3是LPS介导的胃腺癌和卵巢癌细胞中IL-6产生的信号转导途径的重要成分,MEKK3与LPS介导的胃腺癌和卵巢癌细胞中IL-6的产生密切相关,并在LPS介导的胃腺癌和卵巢癌细胞产生IL-6中起重要的调控作用,并且其调控作用具有较强的特异性,其下游信号途径有待进一步研究。