传统的细胞基因学研究是基于群体细胞的统计分析开展的,而掩盖了单细胞之间异质性造成的影响。事实上,即使来源相同的细胞个体之间,也会因为病变而在基因上存在差异。因此从单细胞水平研究基因功能对疾病的早期预防和诊断具有重要意义。随着原子力显微镜（Atomic Force Microscopy,AFM）的发展,AFM已经不局限于表征纳米材料形貌,而逐渐应用于单细胞微纳米操纵领域。正是由于AFM精准的力和位移控制,使其在压痕模式下可以无损伤刺入单个细胞来提取和注射基因,从而实现单细胞基因检测和细胞转染。但是根据国内外的研究发现,由于细胞结构的复杂性,即使商业化的AFM探针拥有纳米级别曲率半径的针尖,其刺入细胞造成细胞膜孔洞的概率还是非常低,这将严重影响AFM在单细胞基因操纵领域的应用。提高AFM探针对细胞膜的刺入率是实现AFM在单细胞基因操纵应用的关键一步,也是前提条件。造成细胞膜孔洞的关键是提高细胞膜的张力,而目前对AFM探针刺入细胞膜引起的张力变化认识不足,因此本文将围绕提高细胞膜张力来提高AFM探针对细胞膜的刺入率这一核心目的展开研究。本文首先通过AFM精确定位压痕模式实现了单个小鼠成纤维细胞的刺入,并在接触模式下对细胞膜压痕后的形貌进行表征,然后在模糊定位压痕实验中发现,传统的AFM锥形探针对细胞膜的刺入率比较低。随后从细胞膜孔洞形成的理论出发,提出了增加细胞膜初始张力和增加AFM探针下压时带来的外部张力的方法,从而提高AFM探针对细胞膜的刺入率,并通过有限元分析方法研究探针压入细胞膜过程中的应力变化来解释其原因。由于实验中无法观测探针刺入细胞膜出现孔洞的动态过程,因此我们通过分子动力学仿真对机械应变下细胞膜孔洞形成和发展的动态过程进行了可视化研究。主要内容和创新性成果总结如下:（1）传统AFM锥形探针对细胞膜的刺入现象及刺入率研究通过AFM锥形探针对小鼠成纤维细胞进行了精确定位区域压痕实验,对比了压痕前和压痕后细胞膜表面的形貌变化,并对压痕后出现的细胞膜孔洞进行了表征,研究发现细胞膜的刺入行为与细胞膜区域有关。为了阐释AFM探针在不同区域压痕结果的差异现象,采用免疫荧光染色方法分析了作为细胞骨架主要成分之一的肌动蛋白微丝的分布,发现了细胞骨架分布不均是造成区域刺入差异的主要原因。而且通过后续的实验发现,在模糊定位下AFM锥形探针对细胞膜的刺入率较低。（2）通过提高细胞膜的初始张力来提高AFM锥形探针对细胞膜的刺入率采用光刻倒模技术制备了具有微沟槽的聚二甲基硅氧烷柔性基底,发现了小鼠成纤维细胞可以沿着特定尺寸的沟槽方向生长延伸。通过对生长在该尺寸下的细胞柔性基底施加应变,从而以增加细胞膜预应力的方式来增加细胞膜的初始张力,分析了预应力对细胞刚度的影响,并采用有限元分析方法验证了预应力增强细胞膜刚度的结论。通过AFM锥形探针模糊定位压痕实验发现,增加细胞培养皿的基底应变可以提高细胞膜的刺入率,并通过耗散动力学仿真对其进行了验证。（3）通过增加AFM探针下压时带来的外部张力来提高细胞膜的刺入率基于壳体的平衡方程,建立了圆柱形探针刺入细胞的力学模型。通过拟合计算发现,在相同的压痕力下,探针的半径越小,细胞膜的张力越大。我们采用显微操纵和聚焦电子离子双束系统制备了直径200nm的圆柱形氮化硅针与直径6nm的碳纳米管针,使用上述探针分别对小鼠成纤维细胞进行了模糊定位压痕实验。研究发现,与传统尺寸较大的AFM锥形探针相比,尺寸小的探针增加了细胞膜的刺入率,并通过有限元分析方法阐释了尺寸小的探针容易引起细胞膜表面的应力集中,从而使细胞膜产生破坏。进而通过在细胞膜上修饰胶原蛋白加固细胞膜的方式,增加了探针下压时的应力集中,提高了细胞膜的刺入率。（4）基于分子动力学的细胞膜在机械应变下孔洞形成和发展的可视化研究基于分子动力学,建立了 1,2-二棕榈酸甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）磷脂双分子层模型,通过分子动力学模拟,在GROMOS53A6力场下研究了磷脂膜在面积应变不断增加下其构型的变化规律。同时计算出磷脂膜张力和应力随着应变增加的变化趋势,探讨了在不同加载应变率下导致细胞孔洞出现的关键应变、张力和应力大小,并且分析了不同加载应变率与磷脂分子模型出现的孔洞数量和面积关系。本文采用AFM压痕实验和多尺度仿真方法研究了细胞膜在机械力作用下产生孔洞的现象,对于细胞膜的破损机制具有一定的理论指导意义。此外,AFM在单细胞基因检测和细胞转染领域具有潜在应用,因此,本文提出的增加细胞膜预应力、改变探针尺寸和修饰细胞膜的方法有效地提高了细胞膜的刺入率,对于实现AFM探针用于单细胞基因操纵领域具有重要的应用指导意义。