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本课题拟将核酸适配体亲合力高、特异选择性强的特性与固相微萃取(Solid-phasemicroextraction,SPME)耗时少、效率高、操作简单等优点结合在一起,在硅烷化石英纤维表面制备一层高通透性的多孔聚合物涂层,再通过化学键合方法将适配体固定到涂层多孔结构中,研制一种基于核酸适配体/多孔聚合物涂层的新型SPME纤维,将基于该纤维的SPME方法与液相色谱质谱(LC/MS/MS)联用,建立复杂生物样品中痕量腺苷类核苷酸物质的高选择性快速分析方法,论文主要内容如下: 1.介绍了固相微萃取技术的特点,综述了SPME技术的原理、装置、涂层制备技术,综述了适配体的结构、特点、以及适配体的应用,重点在样品前处理领域的应用。 2.开展了三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)适配体/多孔聚合物涂层萃取头的制备及表征。以石英纤维为底材,采用多次共聚方法制备厚度可控多孔聚合物纤维涂层,该涂层平均厚度为10.7μm(n=10),相对标准偏差为5.4%,涂层牢固,使用寿命长,重复使用次数可达200次以上。扫描电子显微镜研究结果表明石英纤维涂层均匀致密,表面高度交联,疏松多孔结构,平均孔径大概1μm;红外光谱图表明与空白纤维相比,涂渍后出现了丙烯酰胺的-NH3特征峰;热重分析结果表明,聚合物涂层在低于260℃时具有较好的热稳定性。采用化学键合的方法将ATP适配体固定到多孔聚合物纤维涂层表面,制备得到ATP适配体/多孔聚合物新型SPME纤维涂层,并对核酸适配体键合条件进行了优化,最佳适配体键合条件为:羰基二咪唑浓度0.7mol/L、羰基二咪唑键合时间1.5h、适配体键合时间24h、缓冲液TE,采用Oligreen荧光染料法测定核酸适配体荧光强度,计算得到核酸适配体键合量,分析结果表明,ATP适配体键合率达到25%,键合量为0.0625μg适配体。 3.开展了ATP适配体/多孔聚合物涂层萃取性能及其应用研究,优化了核酸适配体/多孔聚合物涂层-SPME萃取条件,得到最佳萃取条件为:萃取溶剂Tris-HCl、Mg2+浓度10mM、解吸液40%乙腈、萃取时间1.5h、解吸时间15min。以乱序适配体为对照,根据优化的萃取条件对ATP适配体/多孔聚合物涂层选择性、选择容量进行了研究,结果表明ATP适配体结构中存在特定识别ATP的碱基位点,ATP适配体/多孔聚合物涂层对ATP及其结构类似物具有选择性识别能力;通过双碱基错配适配体对照实验,确认了ATP适配体结合ATP的关键碱基位点。建立了核酸适配体/多孔聚合物涂层-SPME-LC/MS/MS联用测定ATP、ADP及AMP的分析方法,线性范围分别为0.005-0.25、0.025-0.25、0.025-0.25μg/mL,检出限分别为0.0027、0.029、0.034μg/mL,该方法用于测定加标血清样品中ATP、ADP及AMP,回收率为77.6%-87,4%。